常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的 建立4种转基因(genetically modified, GM)大米成分多重定量检测方法, 解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品的高通量精准定量难题。方法 采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析, 并将其转化为含量百分比。结果 转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好, 标准曲线r2值均在0.99以上, 定量相对灵敏度可达0.1%, 相对误差和相对标准偏差值均小于25%, 定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论 本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法, 解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点, 为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。     

转基因大米TT51-1品系精准定量检测方法的比较研究

基于大米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因和TT51-1品系特异性基因序列筛选适用于数字PCR的内、外源基因特异性引物探针并建立转基因大米TT51-1品系的双重数字PCR定量方法。其定量的绝对灵敏度和相对灵敏度分别达2 copies/μL和0.1%。当样品中TT51-1转基因大米成分含量低至0.1%时,6次定量值的相对标准偏差在7.30%~18.63%之间,偏差在-8.77%~9.62%之间,精密度和稳定性均较为理想,而同样的引物探针所建立的实时荧光PCR方法定量的相对灵敏度仅达到1%。为促进该方法的标准化应用,将微滴式数字PCR平台上建立的定量方法在芯片式数字PCR平台上进行室内验证,结果表明该方法的定量精密度和准确性符合要求。该方法可应用于大米、稻谷及其初加工产品中TT51-1转基因大米成分的精准定量检测。     

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。     

应用多重PCR-液相悬浮芯片技术检测转基因水稻品系

开展转基因水稻的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）液相芯片检测方法研究。针对科丰6号（KF6）、科丰8号（KF8）、华恢1号（BT63）、克螟稻（KMD1）、M12、T1C-19、T2A-1、LL62和LL601九种转基因水稻的侧翼序列,设计合成了在生物素标记的多重PCR扩增引物与固定在荧光编码微球上的探针,建立了2 个多重PCR-液相芯片检测体系,可同时检测出这9 种转基因水稻成分。结果表明,9 种转基因水稻的引物和探针都具有较高的特异性,各组引物/探针之间无交叉扩增和非特异杂交,且在多重PCR-液相芯片检测中9 种转基因水稻品系的相对检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。     

基于双重微滴式数字PCR对转基因油菜RF1品系的定量方法

基于微滴式数字PCR平台,建立了一种在同一个微滴反应体系中同时检测油菜样品中两种靶标序列的双重微滴式数字PCR(duplex-ddPCR)定量分析方法。试验结果表明,内参基因和品系特异性基因均能特异性扩增出来,所建立的RF1品系duplex-ddPCR方法特异性好。在单位体系内参和外源基因拷贝数位于18~23077的区间内可以呈现出良好的线性,r2=0.999。经验证,本方法的定量检测限(LOQ)和最低检测限(LOD)分别为18拷贝/反应和3.7拷贝/反应。精密度试验结果表明两组浓度的DNA样品所得到的平行试验结果的标准偏差(relative standard deviations,RSD)介于8.40%~24.50%,准确度试验结果显示标准偏差RSD值介于5.97%~12.64%,均达到了对方法精密度RSD和准确度RSD小于25%的要求。综上所述,本研究所建立的duplex-ddPCR定量分析方法可用于转基因油菜RF1的定量检测。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

数字PCR在食源性致病微生物检测中的 应用研究进展

大多数食源性疾病由食源性致病微生物引发,研究和建立食源性致病微生物的快速有效检测方法对于食品安全风险监控及保障人们的身体健康具有重要意义。相对于传统PCR,数字PCR具有较好的准确度和重现性,可实现绝对定量分析,为快速准确地进行食品安全检测提供了一种崭新的技术平台。本文主要介绍了数字PCR中微滴式数字PCR和芯片式数字PCR的基本原理、种类、应用及其研究进展,深入探讨了数字PCR技术在沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、阴沟杆菌和金黄色葡萄球菌等食源性致病微生物检测中的应用。数字PCR技术目前在转基因成分和动物源性成分定量检测中都得到了较好的应用,在食源性致病微生物中的应用技术还有待更好的发展。     

实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米Mon810成分

采用实时荧光PCR技术，建立了定量(性)鉴定检测加工产品中转基因玉米Mon810成分的方法。实验设计的可以扩增玉米自身基因和外源基因边界序列的引物和探针具有品种和品系特异性，特异性地检测出食品、饲料等加工产品中转基因玉米Mon810成分。某些检测样品不仅检出转基因玉米Mon810成分，还同时检出其它转基因玉米品系或其它转基因品种。本研究实验建立的转基因玉米Mon810品系鉴定检测方法，即可以用于加工产品中转基因成分的定量检测(检测低限为0．1％)，也可以用于定性检测，或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）和芯片式数字PCR（chip digital PCR,cdPCR）平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。ddPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0copies/μL和8.2copies/μL;cdPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443copies/μL和7.646copies/μL;ddPCR和cdPCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。     

微滴式数字聚合酶链式反应在食品安全检测领域的应用

微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)是一种新型核酸扩增技术,可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析。其结果具有更高的精准度、准确性和灵敏度,大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用性,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文重点论述了ddPCR法的技术原理、优势以及在食源性致病微生物定量检测、转基因成分分析、食品源性成分检测等食品安全检测领域的应用研究进展情况。     

Development of an event-specific Real-time PCR detection method for the transgenic Bt rice line KMD1

The present study describes an event-specific quantitative Real-time PCR detection method for the transgenic Bt rice line Kemingdao 1 (KMD1). This rice line which is not approved in any country so far is likely to be approved in China in the near future. The developed primers amplify a DNA sequence spanning the integration site of the genetic construct in KMD1. DNA sequence information of this unknown site necessary for primer design was achieved using SiteFinding-PCR technique. The specificity of the detection method was shown by testing a number of different transgenic and conventional plant varieties (e.g. rice LL 601, LL 62, Bt 63). As alternative to genomic DNA, we developed double target hybrid amplicons as synthetic calibration standards in Real-time PCR. These amplicons contained both one copy of the KMD1 event-specific sequence and one copy of a sequence of the rice reference gene gos9. The limit of quantification (LOQ) of the method was tested to be 0.05%. R. Babekova and T. Funk contributed equally to this paper.     

双重实时荧光定量PCR检测转基因植物常用调控元件的适用性研究

目的 建立一种双重实时荧光PCR检测转基因植物中常用调控元件pCaMV35S和tNOS的方法。方法 首先, 通过扩增多个植物DNA来测定此系统的特异性; 然后, 将转基因棉花的模板DNA稀释5个梯度, 检测此方法检出限(Limit of detection, LOD), 建立标准曲线判断该方法的定量能力; 最后, 通过相对模拟掺假试验测定此灵敏度。结果 特异性试验的检测结果显示此系统具备较强的特异性, 能够区分含有上述两种调控元件的转基因植物和非转基因植物。此方法对于pCaMV35S基因的检测限为1 ng, 对于tNOS 基因的检测限为10 ng。依托此方法建立的标准曲线的扩增效率分别为96%和87%, R2均大于0.99, 方法具有定量能力。而且, 方法的相对灵敏度达到1%, 满足混合样品中转基因成分的检测要求。结论 建立的双重实时荧光PCR方法表现出较强的特异性和较高的灵敏度, 有高通量、低成本以及定量检测的能力。     

实时荧光PCR定量测定肉制品中羊源性成分

为准确定量肉制品中羊源性成分的含量,以羊单拷贝基因为扩增靶基因,设计合成羊源的引物、探针,制备羊源和脊椎动物通用基因的重组质粒以构建标准曲线,通过方程算出各自的拷贝数,根据拷贝数的比值计算样品中羊肉源成分占总肉成分的百分比含量,建立荧光定量PCR检测体系,并对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和灵敏度,最低检测到羊的DNA含量为0.02 ng/μL。对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测发现,羊肉掺入量为90%、50%时所得结果相对准确,相对标准偏差分别为5.69%和10.82%, 且不受外源物种的干扰。本试验建立的定量PCR方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现存在掺假现象。     

非洲猪瘟病毒核酸荧光定量PCR检测方法研究

目的 建立非洲猪瘟病毒核酸的荧光定量PCR检测方法, 并与微滴式数字PCR检测方法的优缺点进行比较。方法 根据非洲猪瘟病毒保守基因VP72和K205设计合成引物和探针, 探究荧光定量PCR检测方法的反应条件和方法的特异性、线性、灵敏性和重复性, 及其与微滴式数字PCR检测方法灵敏度差异。结果 本研究建立的非洲猪瘟病毒核酸荧光定量PCR检测方法检出限达到0.1 fg/反应, 在0.1~500.0 fg/反应范围内呈现良好的线性关系, 检测重复性变异系数均低于1%, 不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒发生交叉反应。结论 本研究建立的荧光定量PCR法灵敏度高、特异性强, 适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测。     

Integrated structure and event-specific real-time detection of transgenic <Emphasis Type="Italic">cry1Ac/SCK</Emphasis> rice Kefeng 6

Transgenic rice Kefeng 6 is a transformation event containing two insect-resistant genes, cry1Ac and SCK (modified CpTI gene) in China. In order to monitor the probable release of Kefeng 6 in the future and execute the labeling requirements, it is necessary to develop a rapid and reliable detection method. In this study, both the 5′ and 3′-junction sequences spanning the plant DNA and the integrated gene construct of the rice event Kefeng 6 were isolated by genome walking and long-distance PCR (LD-PCR), successively. Multiple copies of truncated SCK gene and cry1Ac gene were found to integrate into the host rice genome. The event-specific real-time detection method for Kefeng 6 event based on its 5′-junction sequence was established using one plasmid molecule pMD-KF6 containing both 5′-junction sequence and rice endogenous gene gos9 sequence as the reference material (RM) with an absolute limit of quantification (LOQa) around 10 template copies. Thereafter, three different transgenic amounts of w/w mixed samples (5, 1, and 0.5%, respectively) were quantified to assess the performance characteristics of the established real-time PCR method. The accuracy expressed as bias deviated from the 4.00–26.00%, the precision expressed as standard deviation (SD) and relative standard deviation (RSD) deviated from 0.03–0.19 and 3.42–4.76%, respectively. Based on the earlier results, we concluded that the qualitative and quantitative PCR assays were reliable and accurate for Kefeng 6 measurement, and the reference plasmid pMD-KF6 could be a good substitute for the reference material for Kefeng 6 quantification.     

利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米

应用实时荧光PCR技术对转基因大米进行了定性和定量检测研究.本研究以转基因B163大米为材料,采用TaqMan探针技术,对大米中的内源基因蔗糖磷酸合酶SPS和转基因水稻中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子以及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthndngiemis,简写为Bt)杀虫晶体蛋白基因Cry1Ac进行了实时荧光PCR研究,并对外源基因Cry1Ac进行了定量检测和敏感性分析.该实时荧光PCR方法检测结果和常规PCR结果一致,同时不用进行凝胶电泳,更为快速、简便,降低了污染机会,可用于转Bt基因大米的定性和定量检测.