苦参杀虫活性菌株的筛选

为筛选苦参内生菌中对水稻害虫有毒杀作用的菌株,本研究采用研磨法从健康苦参植物的根、茎、叶和种子中进行菌株分离。用玻片浸渍法和喷雾法筛选产杀虫活性物质菌株,获得细菌93株、放线菌15株、真菌5株。经初筛及复筛,发现RoF2和LeB8两株菌株的发酵液粗提物分别对稻飞虱Rice planthopper、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis Guenee致死率达85%以上。苦参内生菌株LeB8和RoF2的粗提代谢物对稻纵卷叶螟和稻飞虱有明显的毒杀作用,为开发新的生物源农药提供了可能的生物质。     

关于三株新血清型菌株补充绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)的建议

作者在研制绿脓杆菌(PA)国际抗原分型系统(IATS)的基础上,收集了600余株绿脓杆菌,经生物学特性鉴定,交叉凝集试验和凝集素吸收试验,筛选出 CMCC-10117、PA-87、NO.446、PA-26、PS-1135株菌株(其中 NO.446、PA-26和 PS-113 3株为同型)系 IATS 不能包括的新血清型菌株。根据其抗原特异性从中选取了3株加入 IATS 中,使 IATS 由17个血清型发展为20个血清型。以新选出的MCC-10117作为 IATS-18型,PA-87作为 IATS-19型,NO.446作为 IATS-20型,经用468株临床分离的绿脓杆菌分型考核,分型率为99.4%。     

绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)-20型血清的试制及应用

本文根据“绿脓杆菌IATS补充三株新血清型菌株的建议”,将3株新菌株加入到IATS中,使IATS由17个血清型发展为20个血清型,并中量试制3批IATS-20血清,经检定符合新制定的“绿脓杆菌分型血清制造及检定规程”要求。为此,曾将3批分型血清赠送给国内外有关实验室进行应用考核,现收到4个国家10个实验室的应用考核结果,共计检定了1685株绿脓杆菌,其总的分型率为97.51％,所加入的3个新血清型菌株占分离菌株数的3.62％,但巴基斯坦和美国较多,分别为9.64％和7.(?)％,说明加入此3个血清型十分必要。     

问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征分析

目的　分析问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征。方法　根据问号钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库 ,应用BLAST ,Tmpred ,Pfam等软件分析问号钩体Ⅱ型分泌系统的基因组成和编码蛋白的结构特征 ,并比较问号钩体与铜绿假单胞菌和大肠埃希菌K12Ⅱ型分泌系统组成蛋白的同源性。结果　问号钩体中与Ⅱ型分泌系统相关的蛋白有 11个 ,其中 6个为一般分泌途径蛋白 ,5个为Sec分泌途径蛋白 ,问号钩体中可能存在Ⅱ型分泌系统 ,但一些辅助蛋白未发现 ,需要进一步研究。结论　初步预测了问号钩体中Ⅱ型分泌系统的作用模式 ,为深入研究问号钩体的致病机制奠定基础     

豚鼠自然感染病牛沙门氏菌病的病原学及病理学研究

从自然发病或死亡的34只豚鼠的肝、脾、胆囊和肠系股淋巴结等分离出一种生物学性状完全相同的致病菌，经鉴定这些菌株具有相同的生化学和血清学特性．其抗原结构是6，8：r：1，5，属于沙门氏菌属的C2群的病牛沙门氏菌血清型。经病理检查证实该菌对豚鼠具有较强的致病性，能引起急性小肠炎、胆囊炎以及在单枚巨噬细胞系统有特征性伤寒样肉芽肿病变。本实验结果明确证实病牛沙门氏菌血清型是引起豚鼠沙门氏菌病兽疫流行的新病原之一。     

多型钩端螺旋体外膜菌苗接种后的人体反应观察

1．菌苗：三型钩体外膜苗为黄疸出血群赖型、七日热群七日热型及流感伤寒群流感伤寒型的外膜提取物，每型200μg／ml。五型钩体外膜苗除含上述三个型外，还含秋季热群秋季热型和犬群犬型的外膜提取物，每型100μm／ml。三型钩端螺旋体菌苗（简称钩体菌体苗）和五型钩体菌体苗作为对照，菌浓度三型菌体苗为1．5×108／ml，五型菌体苗为1×108／ml，菌型和比例分别与三型和五型外膜苗相同。安慰剂为pH7．1～7．3的磷酸盐缓冲液。2．观察对象：江苏省深水县非钩体流行区某中学初高中学生，年龄在13～18岁，各型抗体检测均为阴性。苗苗注射前，…     

钩体疫苗免疫小鼠最佳剂量的筛选

<正>钩端螺旋体病(钩体病)为一种分布广泛的人兽共患病,呈世界范围流行,我国为该病的高发地区之一。接种安全、有效的疫苗是预防钩体病的有效手段。为研究人用钩体疫苗免疫小鼠的最佳剂量,为进一步研究疫苗的安全性及有效性提供依据,本文采用上海生物制品研究所生产的三价钩体疫苗(包括黄疸出血型、流感伤寒型、秋季型,每型菌不少于1.5×108条/ml,剂量5 ml)免疫小鼠,筛选最佳免疫剂量,为下一步多种疫苗联合接种的研究奠定基础。     

犊牛腹泻大肠埃希菌O-抗原血清型鉴定

目的对犊牛腹泻大肠埃希菌O-抗原血清型进行鉴定。方法收集内蒙古部分地区牛场患犊牛腹泻病的犊牛直肠内容物或粪便共165份,经细菌分离培养、动物致病性试验及16s RNA PCR检测,筛选出致病性大肠埃希菌,并进行O-抗原血清型鉴定。结果分离的大肠埃希菌共165株,115株有致病性,除7株未能确定分型及3株自凝集外,其余105株鉴定为O-抗原血清型。结论大肠埃希菌O-抗原血清型鉴定对流行病学调查及疾病预防均有重要意义。     

6株金黄色葡萄球菌菌株的鉴定

目的对6株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus,简称金葡菌)菌株进行鉴定,为研制相关疫苗提供参考。方法将稀释的6株疫苗研制用备选金葡菌菌株49521、12602、49525、12605、55804、10832及质控菌株25923、12228菌悬液划线接种TSA平板及Columbia血平板,观察菌落形态,并涂片染色镜检;利用API Staph生化试剂盒、staphylase test血浆凝固酶检测试剂盒及30μg头孢西丁药敏纸片对菌株进行鉴定;利用PCR法鉴定菌株16S r RNA基因、荚膜基因型及mec A基因;用系列稀释的菌悬液经腹腔注射BALB/c小鼠,初步测定菌株毒力。结果6株金葡菌经平板培养,可见圆形、凸起、不透明、有光泽的菌落,Columbia血平板培养的菌落周围可见透明溶血环,镜检结果为革兰阳性球菌,呈单、双或葡萄串状排列。6株菌株的生化反应结果相同,且与质控菌株25923反应结果一致;6株菌株的凝固酶试验结果均为阳性,均对头孢西丁敏感,均未扩增出mec A基因片段,为甲氧西林敏感菌株(methicillin sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)。6株菌株均扩增出1 544 bp的16S r RNA基因片段,与Gen Bank中的参考序列NR_075000.1的同源性均为99%;菌株49521、12605、55804、10832均扩增出340 bp的cap5基因片段,与Gen Bank中序列U81973.1的同源性为99%~100%;菌株12602、49525均扩增出171 bp的cap8基因片段,与Gen Bank中序列U73374.1的同源性均为100%。6株菌株的半数致死量(LD50)均在2.5×108~2.5×109 CFU之间。结论对6株疫苗研制用备选金葡菌进行了鉴定,为疫苗研制中菌株鉴定及不同荚膜型菌株的选择提供了参考。     

应用地高辛标记的寡核苷酸探针测定小肠结肠炎耶氏菌的耐热毒素

一个由23碱基组成的寡核苷酸片段经地高辛(Digoxigenin-11-DUTP)标记作为探针,能特异地测定小肠结肠炎耶氏菌的耐热毒素(yst)。135株致病性小肠结肠炎耶氏菌分布于0∶3,0∶5,0∶8和0∶9四个血清型。用此地高辛标记探针作菌落原位杂交试验,测得121株菌含 yst 基因,而用乳鼠试验测定时,仅26株菌显示肠毒素活性,其中,由败血症病人分离的9株0∶8型菌株均未能与此标记探针杂交。     

柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫性

目的　研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法　用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果　小鼠免疫 1针后均能抵抗国内 11株和国外 11株乙脑病毒的攻击 ,保护率均可达 90 %以上 ;人体免疫血清对台湾 1株和国外 9株病毒均有明显的中和作用。结论　SA14 142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。     

狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析

目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。     

埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征

目的分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echovirus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征。方法分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定。应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对;Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接;应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树。结果从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp。MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6%～98.0%和87.5%～99.3%,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7%～98.0%和97.0%～99.3%,其中与中国江苏分离株M10MF37 China2010核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为98.0%和99.3%,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性最低,分别为78.6%和87.5%。基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝。结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝。     

安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒的N基因序列分析

目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的N基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测RABV抗原,并通过颅内接种昆明乳鼠进一步鉴定毒株;RT-PCR扩增分离病毒的N基因,与pMD18-T载体连接测序后,与代表性RABV街毒株及疫苗株的N基因序列进行比对,并进行遗传学分析。结果在送检的131份犬脑组织样品中检出RABV阳性19株,其中伤人犬脑组织阳性率为90%,狗肉市场犬脑组织阳性率为8.26%。19株RABV N基因核苷酸序列同源性为97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%～100%;与代表性人用和兽用RABV疫苗株相比,N基因核苷酸序列同源性为85.4%～89.9%,推导的氨基酸序列同源性为94.9%～99.1%,核苷酸序列的变异主要为同义突变。分离的19株RABV在系统进化树上高度聚集,与以往国内分离的代表性街毒株系统进化关系较近,在同一个分支(HN10除外)与我国疫苗株CTN-181株亲缘关系最近,处于同一个亚群。结论从安徽省伤人犬和狗肉市场的犬脑组织中成功分离并鉴定了19株RABV,这些病毒株均属于基因I型RABV,且具有地域性特征。本研究对特定区域RABV的流行及监测具有一定的意义。     

我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后的生物学特性

目的鉴定我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后(命名为JX08-45CC株)的生物学特性。方法通过全基因组序列分析比对、小鼠脑内和外周攻毒试验和免疫原性试验,分别对JX08-45CC株的基因组特点、毒力和免疫原性进行鉴定。结果 JX08-45CC株的基因组序列与JX08-45株比对,共出现16个核苷酸突变点和7个氨基酸突变点,其中6个氨基酸变异发生在G蛋白(333位精氨酸未改变)编码区,L蛋白仅有1个氨基酸突变;在G蛋白氨基酸变异中,4个突变序列在其他细胞适应毒株CVS-11、CTN-1、Nishigahara、SAG2、Flury-LEP和SRV9中也普遍存在。JX08-45CC株培养滴度≥107TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为100%,滴度为102～106TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为20%～80%;滴度为105～108TCID50/ml时,外周肌肉接种小鼠,致死率为10%～70%;脑内和外周攻毒小鼠的潜伏期均为7～9 d,并于发病后24～48 h死亡。JX08-45CC株与狂犬病病毒CVS-11、ERA、SRV9和Flury-LEP株的中和抗体滴度差异均无统计学意义(P>0.05)。结论已对JX08-45CC株的基因组序列、毒力和免疫原性等生物学特性进行了鉴定,为开发具有我国自主知识产权的兽用狂犬病灭活疫苗候选株奠定了基础。     

Identification of Lactobacillus spp. in colostrum from Chilean mothers

The biodiversity of Lactobacillus spp. in colostrum samples from 116 Chilean mothers was analyzed by PCR and 16S rDNA sequencing. Lactobacilli were isolated in 55.3% of the samples, with concentrations of 3.33 +/- 0.55 (log CFU/ml). The predominant species were L. plantarum (64%), L. fermentum (16%) and L. pentosus (9%). 28% of the isolated strains were resistant to gastric pH and bile salts, suggesting that they could be used as probiotics.     

不同温度培养的3株EV71毒株的增殖动力学分析

目的对不同温度培养的3株EV71中国流行株的增殖动力学进行分析。方法分别在32、35、37和40℃条件下对FY23、K9和S1株EV71进行传代培养、2～24h培养及噬斑培养,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;传代培养的子代病毒通过脑内注射方式感染新生ICR乳鼠,观察病毒的致病性。结果传代培养时,在32和40℃培养的3株病毒致细胞完全病变时间较35和37℃延长,且子代病毒滴度下降,35℃培养的病毒滴度较37℃升高;3株病毒培养24h后,37℃培养的病毒增殖效率最高,35℃次之,40℃最低;4个温度培养的病毒噬斑形态无明显变化;新生乳鼠脑内注射致死率差异无统计学意义(P>0.05)。结论培养温度的变化可影响EV71的致细胞病变速度及子代病毒的增殖,但对病毒噬斑的形态及新生乳鼠的致病能力无明显影响。