细菌Ⅴ型分泌系统的研究进展

革兰阴性(Gram-negative,G-)菌的分泌系统至少有9种,依次命名为Ⅰ～Ⅸ型分泌系统,其中V型分泌系统(type V secretion system,T5SS)亦被称为自主转运分泌系统(autotransporters,AT),广泛存在于G-菌中.该系统分泌的蛋白占G-菌外泌蛋白的比例最高.该系统只含1或2...     

问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB_2和fliR的克隆及原核表达系统的构建

目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测目的融合蛋白的表达。结果问号钩体56601株flhA、flhB2和fliR基因扩增片段的核苷酸序列与报道的相应序列同源性分别为100%、99·9%和99·9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99·8%和100%。所构建的重组原核表达系统在IPTG的诱导下,能有效地表达目的融合蛋白Trx-FlhA、Trx-FlhB2和Trx-FliR,产量约为细菌总蛋白的10%。结论已成功构建了问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR原核表达系统。     

微生物高效分泌蛋白质的策略与应用

相比于胞内蛋白的生产,利用微生物细胞工厂生产分泌型蛋白具有更快速、便捷和下游分离工艺简单等优势。因此,首先概述了细菌微生物与真菌微生物不同的蛋白分泌系统和分泌机制,并分析了在蛋白分泌过程中,不同蛋白分泌系统、蛋白折叠和分泌过程、代谢负担与发酵培养条件对微生物高效表达分泌蛋白的影响以及导致的一系列瓶颈问题。基于以上瓶颈问题,分别从分泌蛋白表达体系、蛋白分泌途径组分、组学研究与发酵条件等方面进行了系统分析并提出相应的优化策略,为提高分泌蛋白的产量提供更多可用的信息与借鉴,旨在为今后利用微生物作为细胞工厂实现外源蛋白的高效分泌生产提供一定的理论基础与技术支持。     

钩端螺旋体外膜蛋白基因重组载体构建及在卡介菌中的表达

目的　研制一种高效广谱的新型钩体疫苗。方法　用PCR方法扩增致病性钩端螺旋体赖型 0 17株外膜蛋白OmpL1基因 ,将其克隆入大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒载体pMV2 6 1和pMV36 1中。结果　筛选到两个重组载体pBQ1和pBQ2 ,通过电穿孔导入卡介菌 ,重组体经诱导表达了相对分子质量约为 35 0 0 0的融合蛋白。结论　卡介菌能有效表达钩体抗原蛋白     

6省市28株钩体菌株血清学检定及2个新型菌株的发现

目的　为了解洪涝灾害对钩端螺旋体 (钩体 )病流行菌型的影响 ,在我国钩体病流行比较严重的省市地区进行菌株分离观察。方法　采用经典的显微镜凝集试验和交叉凝集素吸收试验进行血清学分类比较。结果　 6省市的 2 8株钩体菌株分属 7个血清群 9个血清型 ,其中发现 2个新的血清型 ,暂定为贺岩型和沅江型 ,代表菌分别为L2 31株和沅江 2 7株。结论　对流行区的 2 8株钩体菌株进行了血清学分类 ,为钩体病的诊断提供了新的依据。     

瓜氨酸生产相关基因簇在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达

构建1种组成型载体并将载体应用在表达瓜氨酸相关基因簇argCJBDF上。通过去除pXMJ19诱导型启动子上游阻遏蛋白lacI基因的方法,构建组成型质粒pXMJ19-lacI,并将谷氨酸棒杆菌中合成瓜氨酸途径的基因簇argCJBDF克隆到改造过的组成型载体中,实现瓜氨酸合成相关基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌的组成型表达。结果表明:重组菌在30℃摇瓶发酵72 h后,N-乙酰谷氨酸激酶的酶活达到(0.323±0.015)U/mg,瓜氨酸的产量达到4.33 g/L。成功构建的组成型表达载体,实现了外源基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达。     

多型钩端螺旋体外膜菌苗接种后的人体反应观察

1．菌苗：三型钩体外膜苗为黄疸出血群赖型、七日热群七日热型及流感伤寒群流感伤寒型的外膜提取物，每型200μg／ml。五型钩体外膜苗除含上述三个型外，还含秋季热群秋季热型和犬群犬型的外膜提取物，每型100μm／ml。三型钩端螺旋体菌苗（简称钩体菌体苗）和五型钩体菌体苗作为对照，菌浓度三型菌体苗为1．5×108／ml，五型菌体苗为1×108／ml，菌型和比例分别与三型和五型外膜苗相同。安慰剂为pH7．1～7．3的磷酸盐缓冲液。2．观察对象：江苏省深水县非钩体流行区某中学初高中学生，年龄在13～18岁，各型抗体检测均为阴性。苗苗注射前，…     

红色毛癣菌孢子中预存储mRNA的功能

目的分析红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)孢子中预存储mRNA的功能。方法通过分析560个孢子中预存储基因与NR和GO数据库中其他线性真菌基因的同源性,对这些基因的功能以及可能参与的生理过程进行探讨。结果在孢子中的560个基因中,有177个与烟曲霉、构巢曲霉、粗糙链孢菌和红色毛癣菌4类线性真菌基因有同源性,并发现一些可能参与孢子萌发的重要基因及相关的调控途径。结论为进一步研究红色毛癣菌孢子中预存储基因的作用以及孢子萌发的机理提供了依据。     

毕赤酵母组成型表达载体的构建及报告蛋白表达评价

目的构建毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型分泌表达载体,并表达报告蛋白葡萄球菌核酸酶(staphylococcus nuclease,SNase,NucA),以评价其表达外源蛋白的能力。方法从巴斯德毕赤酵母GS115基因组中PCR扩增毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,pGAP)片段,克隆至载体pPIC9K中,构建组成型分泌表达载体pGHKα;从金黄色葡萄球菌基因组中PCR扩增编码报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的序列nucA,克隆至载体pGHKα中,构建重组表达质粒pGHKα-nucA,经SacⅠ和BglⅡ依次酶切线性化后,电转化至毕赤酵母GS115中;PCR及TB-D平板法筛选阳性重组酵母菌;Tricine-SDS-PAGE检测表达产物;琼脂扩散法检测重组酵母菌表达上清液的核酸酶活性。结果组成型分泌表达载体pGHKα经PCR鉴定,证明构建正确;重组表达质粒pGHKα-nucA经PCR及测序鉴定,证明nucA基因片段正确插入载体pGHKα中;重组酵母菌GS115/pGHKα-nucA经PCR及TB-D平板法检测证明构建成功;表达的目的蛋白相对分子质量约为17 000,表达量约占上清总蛋白的42%,且具有显著的核酸酶活性。结论成功构建了毕赤酵母组成型分泌表达载体pGHKα,其能正确表达报告蛋白NucA,且表达的蛋白能分泌到细胞外,表达效率高,为异源蛋白在毕赤酵母中的安全高效表达奠定了基础。     

诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

目的探讨诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在毕赤酵母表达系统中分泌表达的可行性。方法用pPICZa-A表达载体和X-33毕赤酵母株进行NoV GⅡ.4和GⅡ.17型VP1蛋白的分泌表达,并对阳性菌株进行Mut表型筛选。同时优化起始pH(5.0、6.0、7.0、8.0)、甲醇终浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)及发酵时间(24、48、72、96、120 h)3个表达条件。取原始及传代10代菌株,采用优化条件进行发酵,于诱导0～60 h间,通过双标准曲线实时荧光定量PCR法测定外源基因拷贝数。发酵产物经蔗糖密度梯度离心纯化后,检测其浓度及纯度,并观察VLP的形态。结果表达目的蛋白的重组酵母菌株均为Mut~+型。最佳发酵pH为7.0,甲醇终浓度为1%,发酵时间为72 h。菌株传代后未发生基因缺失,整合基因在10代内稳定性良好。GⅡ.4及GⅡ.17型VP1纯度均约85%,浓度分别为133和165μg/mL,VP1蛋白均可自发组装成直径约40 nm的VLP颗粒,形态与天然病毒相似。结论用毕赤酵母表达系统进行NoV VP1蛋白VLP分泌表达是可行的。     

Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的重组表达Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白。方法用PCR的方法从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入pMD18T载体,构建原核表达载体pET32aSIP,用BL21(DE3)/pET系统表达TrixSIP融合蛋白,SDSPAGE和质谱分析鉴定表达产物,并对表达蛋白进行初步纯化。结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中Ⅰa/c型GBS的SIP的基因序列同源性为99%。SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET32aSIP总蛋白中出现一条相对分子质量为66000的新蛋白带。质谱分析和蛋白质库的比较证实其为B族链球菌表面免疫相关蛋白(SIP)的可能性分数为74。结论已成功表达并初步纯化SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

乙肝病毒前S1基因与截短C基因穿梭表达载体构建

目的构建HBV前S1基因和截短C基因分泌型大肠杆菌和分枝杆菌穿梭质粒。方法以含HBV基因组质粒pCP10序列为模板,PCR扩增前S1基因和C基因截短片段,依次克隆至分泌型穿梭表达载体pDE22,电穿孔转化法将重组质粒导入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆热休克诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析。结果扩增到了预期长度的2个目的基因,构建了分泌型穿梭载体,SDS-PAGE分析可见相对分子质量约23000蛋白表达条带。结论已成功构建耻垢分枝杆菌分泌表达前S1基因和截短C基因的穿梭载体,为研究含前S基因和截短C基因的重组BCG疫苗奠定了基础。     

钩端螺旋体黄疸出血群赖株LipL41基因的克隆表达及鉴定

目的　对钩体黄疸出血群赖株LipL4 1基因进行克隆、表达及鉴定。方法　采用高保真PCR ,从我国钩体黄疸出血群赖株基因组中扩增全长LipL4 1基因片段 ,并构建原核表达系统。结果　所克隆的LipL4 1基因核苷酸和氨基酸序列与已发表LipL4 1基因序列 (GenbankL4 6 794 )同源性分别为 96 2 5 %和 98 87% ;所表达的目的蛋白经Westernblot证实为具有良好免疫反应性的广谱抗原。结论　可作为研制基因工程疫苗的候选抗原     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的在毕赤酵母中分泌表达猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白。方法将PCV2-Cap蛋白基因(Gen Bank登录号:KC620508.1)按毕赤酵母偏好密码子优化后,插入毕赤酵母分泌型表达载体p PICZαA中,重组质粒p PICZαA-Cap经SacⅠ线性化,通过电击转化整合至毕赤酵母GS115菌株的基因组中,构建p PICZαA-CapGS115重组酵母菌。经甲醇诱导表达重组Cap蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-Cap经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌p PICZαA-Cap-GS115经菌落PCR鉴定,可扩增出1 001 bp的目的基因片段;表达的重组Cap蛋白相对分子质量约49 000,可与猪圆环2型阳性血清和小鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应。结论成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为PCV2亚单位疫苗和ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

钩体疫苗免疫小鼠最佳剂量的筛选

<正>钩端螺旋体病(钩体病)为一种分布广泛的人兽共患病,呈世界范围流行,我国为该病的高发地区之一。接种安全、有效的疫苗是预防钩体病的有效手段。为研究人用钩体疫苗免疫小鼠的最佳剂量,为进一步研究疫苗的安全性及有效性提供依据,本文采用上海生物制品研究所生产的三价钩体疫苗(包括黄疸出血型、流感伤寒型、秋季型,每型菌不少于1.5×108条/ml,剂量5 ml)免疫小鼠,筛选最佳免疫剂量,为下一步多种疫苗联合接种的研究奠定基础。     

枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

目的克隆、表达枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因,并检测其酶学性质。方法从枯草芽孢杆菌染色DNA中,PCR扩增枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因Sapr,插入载体pET-28a(+)中,构建重组分泌型表达质粒pET-28a-Sapr,热激转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),25及37℃条件下,IPTG诱导重组蛋白表达,表达的重组蛋白经10%SDS-PAGE分析,并采用Folin法测定酶活性。结果重组表达质粒经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确,测序结果表明与GenBank中登录的序列同源性达100%;表达的重组蛋白相对分子质量约39 600,最佳诱导温度为25℃,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的12%;重组菌发酵产物酶活性为322 U/ml。结论在大肠埃希菌中成功表达的特异蛋白具有生物学活性,为进一步研究改性分离蛋白的功能特性奠定了基础。     

钩端螺旋体外膜蛋白致病性及免疫性研究进展

钩端螺旋体外膜蛋白在钩端螺旋体的致病与免疫应答过程中起着十分重要的作用,它在疾病感染时既可以作为一种外膜毒性物质,又可以作为一种特异性抗原而诱导免疫应答。本文作者对钩端螺旋体外膜蛋白的生物学特性、致病机理和免疫原性作了全面的综述,为有效地筛选特异的钩体候选疫苗提供可靠的依据,也为特异地诊断和预防钩体病奠定基础。     

胞外DNA在生物膜形成及发展过程中的作用

生物膜是微生物为适应环境变化而形成的特殊的微生物聚合体,包括微生物细胞和胞外聚合物(EPS)等。胞外DNA(eDNA)是EPS的关键组成成分之一。它通过细菌主动分泌、细胞溶菌作用等释放到胞外,吸附在细菌细胞表面并开始向外延伸,从而促进生物膜的形成。另外,它可以为细菌代谢提供营养物质,作为基因水平传递的"基因仓库",与胞外蛋白及胞外多糖等交联,维持生物膜空间结构。因此,关于生物膜中eDNA的研究,对水处理、生物冶金、医学及食品安全等领域具有重要的意义。文章系统性地综述了eDNA的产生途径、调节机制、功能及目前研究的局限性等,并对未来的研究方向作了分析。     

锌指蛋白在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中的研究进展

简要介绍了C2H2型、C4型和C6型三类锌指蛋白,分别从三类锌指蛋白总结了其在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中发挥的作用,举例分析了锌指蛋白在纤维二糖水解酶Ⅰ和纤维二糖水解酶Ⅱ编码基因上表达调控的过程,结合相关研究总结了锌指蛋白在丝状真菌产纤维素酶中应用,最后指出通过该方面研究将有助于在分子水平上揭示纤维素酶表达调控的机理,为高效率、低成本生产纤维素酶奠定基础。     

YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中,这样不仅有利于蛋白的正确折叠,也会极大地简化目的蛋白的提取和纯化过程。近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽,大小为10.8kDa;虽然其功能未知,但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。综述了YebF蛋白的结构及其胞外分泌表达的机理,总结了应用YebF分泌途径成功胞外表达异源蛋白的例子,阐述了利用YebF胞外分泌途径提高目的蛋白表达量的策略,为更多重组蛋白的高效分泌表达提供了理论基础。