实时荧光PCR定量检测食品中单增李斯特菌

目的建立快速、敏感、特异的食品中单增李斯特菌检测方法。方法针对单增李斯特菌溶素A基因（hlyA）设计一对引物和一条探针，并用该引物和探针运用实时荧光PCR技术对单增李斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行实时荧光PCR定量检测。结果利用实时荧光PCR技术，建立了DNA校正曲线、细胞校正曲线和质粒校正曲线。DNA校正曲线在1～32CFU/ml、细胞校正曲线在32—320CFU／ml、质粒校正曲线在1—37Copies／ml，线形关系良好，且三种校正曲线检测样品得出的结果基本吻合。结论本试验建立起来的实时荧光PCR定量检测单增李斯特菌的方法灵敏度高、特异性好、准确，可应用于食品中单增李斯特菌的检测。     

应用PCR技术快速测定食品中单核细胞增生李斯特菌毒力

目的：采用PCR 技术准确、快速测定单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特氏菌)分离株的毒力基因,鉴别强毒株和弱毒株或无毒株,以有效地限制李斯特氏菌病的传播。方法：以单增李斯特氏菌相关毒力基因(hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA)设计引物,检测重庆市2007 - 2009 年分离的40 株单增李斯特氏菌分离株中的毒力基因携带率,并进行小鼠毒力实验。结果：40 株分离株中有15 株7 种毒力基因检测结果均为阳性,6 株hly 基因阴性,4 株plcB 基因阴性,4 株prfA 基因性,5 株inlA、inlB 基因阴性,11 株inlC 基因阴性,9 株inlJ基因阴性,1 株inlA、inlB、inlC、inlJ 基因均为阴性。4 株分离株的毒力与标准菌株ATCC191161E 相当,小鼠LD50 在1.2 × 108～6.0 × 108CFU/mL 之间,为强毒株。筛选出弱毒株09-132,LD50 为1.7 × 1011CFU/mL。结论：重庆市存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险,内化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因,而prfA 和plcB 基因与菌株毒力的相关性较小。     

单核细胞增生李斯特氏菌的PCR检测方法

研究比较了裂解法、热煮沸法、试验盒法提取单增李斯特氏菌DNA的效果 ,认为Promega试剂盒法提取的DNA ,得率高、纯度好。同时根据单增李斯特氏菌的毒力相关基因的 5对引物 ,进行了引物的特异性研究 ,结果发现inlA引物、inlB引物、plcA引物特异性好 ,可以用于食品中单增李斯特氏菌的检测     

七类食品单核细胞增生性增李斯特菌污染状况调查

利用李斯特显色培养基对食品中单增李斯特菌进行分离纯化后,提取基因组DNA,用PCR技术扩增hlyA基因特异性350bp的片段和iap基因特异性1500bp的片段,用此方法对七类食品进行检测。结果表明,冬春夏三季采集的62、60、62份样品中,分别检出单增李斯特菌3株、3株、10株,污染率分别为4.84%、5%、16.13%。夏季单增李斯特菌的污染情况比冬季和春季严重,其中蔬菜和牛奶中未检出单增李斯特菌;PCR检测可用于单增李斯特菌快速、特异、敏感检测。     

食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究

为提高食品中单增李斯特菌的检测水平,针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因hlyA、plcB、prfA、iap,设计并筛选出7对引物组成多重-巢式PCR联合检测体系,并结合高灵敏性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,对单增李斯特菌进行快速检测,多重PCR的灵敏度达到1×102CFU ml,巢式PCR的灵敏度达到1×10CFU ml。结果表明该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,而且有效缩短了检验周期,从传统的7～14d缩短到1～2d。     

LAMP法检测单核细胞增生性李斯特菌的研究

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌,属李斯特菌属,是食源性致病菌中的一种,它能够引起人畜共患病,在食源性细菌中毒中占主要地位。为了鉴定该菌,以单增李斯特菌的内化素基因(inlA)为靶基因,通过LAMP法对该基因扩增,并优化其反应条件。过夜培养的单增李斯特菌的菌液,取1 mL提取细菌基因组DNA,提取完成后测得其DNA含量为227 ng/μL,然后依次将其进行10倍梯度稀释,并以此作为LAMP实验模板,最终实验结果表明,LAMP检测单增李斯特菌纯菌培养物的检测限为2.27 fg/μL。     

恒温实时荧光法快速检测不同样品中的单增李斯特菌

为实现乳制品中、临床病人腹泻物中单增李斯特菌的快速检测,选用外引物F3和B3、内引物FIP和BIP作为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,采用便携式荧光恒温扩增仪作为检测平台,选取单增李斯特菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定;选用人工污染的15份乳制品样品和20份腹泻样品进行适用性实验;以上样品同时利用国标法GB4789.30-2010进行菌落计数。结果表明:恒温实时荧光法对纯培养的单增李斯特菌基因组DNA、乳制品和腹泻样品中的单增李斯特菌基因组DNA灵敏度均达到10~2CFU/mL、检测限均达到10~3 CFU/mL;阴性样本出现假阳性的概率分别为0、0.03%和0;单增李斯特菌污染浓度在检出限以上的阳性样本检出率分别为100%、99%和92%。研究表明恒温实时荧光法的检测结果与传统国标培养结果基本一致,恒温实时荧光法适用于乳制品中和临床腹泻样本中单增李斯特菌的快速检测。     

基于实时荧光定量PCR检测的沙门氏菌标准物质验证

该研究拟采用沙门氏菌核酸标准物质验证实时荧光定量PCR检测沙门氏菌,并对沙门氏菌核酸标准物质的适用性、均匀性、稳定性进行考察。使用不同的PCR仪进行检测比较,建立不同的PCR酶体系,并在沙门氏菌核酸标准物质中添加保护剂,以此来验证沙门氏菌核酸标准物质的适用性;同时根据线性图、参数表对沙门氏菌核酸标准物质进行均匀性、短期稳定性和反复冻融稳定性分析。结果表明研究设计的荧光定量PCR方法辅以标准物质具有良好的种属特异性,适用于常见的PCR仪和不同的酶体系,保护剂不影响沙门氏菌核酸的荧光扩增。研制的沙门氏菌标准物质样品均匀,未稀释的沙门氏菌核酸检测样在实验中6 d内量值保持稳定,反复冻融10次后的量值也相对稳定,溶解于保护剂的低浓度沙门氏菌核酸检测样稳定性加强,但低浓度沙门氏菌核酸检测样短期稳定性及反复冻融实验量值不稳定。辅以标准物质的实时荧光定量PCR技术检测准确度高且稳定,可用来验证各实验室的检测能力,实现微生物核酸检测技术的快速、准确、可溯源。     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌

单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌.为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性.结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应.单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml.而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml.人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml.此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查.     

食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的制备方法,研制均匀稳定的标准物质。方法利用冷冻干燥法制备103 CFU/样品的标准物质,参照CNAS-GL 29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,抽取20件样品,利用平板计数法测定标准物质的均匀性,并对结果进行统计分析;将样品分别置于-20、25、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定,使用30种即食熟肉制品作为基质,并按照国标法检验标物物质的适用性。结果采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=0.922,符合标准物质的要求。标准物质在-20℃保藏28 d, 25、37℃保藏7 d,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均在103 CFU/样品的水平;标准物质加入到30种即食熟肉制品中,均可以检出单核细胞增生李斯特氏菌。结论本研究所制备的单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测结果的评价。     

一株食源性多重耐药单核细胞增生李斯特菌的耐药性研究

本研究对食品样本中分离的一株多重耐药单核细胞增生李斯特菌进行耐药机制的探讨,以期对食源性单核细胞增生李斯特菌多重耐药现象的控制提供理论依据。本文通过聚合酶链式反应筛选耐药决定因子,质粒消除及自然转化实验对耐药决定因子进行定位及传播能力的探讨,最后通过传代实验验证该菌株多重耐药性传播的稳定性。结果表明,对检测到的多重耐药菌株LM78(耐受氯霉素、红霉素、链霉素、四环素、复方新诺明)进行相关耐药基因检测,检测到cat、erm B、tet S 3个耐药基因。质粒消除后MIC值下降到敏感范围,且该质粒可通过自然转化在不同菌属间传递,说明这些耐药基因存在于质粒上。该质粒在无抗生素选择压力下连续传代,仍具有较高稳定性。食源性致病菌多重耐药性有可能通过不同细菌种属间转移,进而由食物链向人类传播,对人类健康造成潜在的威胁。     

Effect of Filling Type and Heating Method on Prevalence of Listeria species and Listeria monocytogenes in Dumplings Produced in Poland

The count of Listeria monocytogenes was determined, before and after heat treatment, in 200 samples of dumplings of 9 brands and with different types of stuffing. Analyses were conducted according to ISO 11290–1 standard and with real‐time PCR method. The highest count of L. monocytogenes was found in meat dumplings (10² to 10⁴ CFU/g), whereas products with white cheese‐potato stuffing and vegetable‐mushroom stuffing contained significantly less Listeria, 20 to 80 and 5 to 32 CFU/g, respectively. In cooled meat dumplings the extent of contamination depended significantly on the producer. In addition, a significant (P < 0.05) correlation was determined between contamination level and meat content in the stuffing (rho = 0.418), especially in stuffing containing pork meat (0.464), contrary to beef‐containing stuffing (0.284). Heating dumplings in boiling water for 2 min completely eliminated L. monocytogenes in meat dumplings. In contrast, the microwave heating applied for 2 min at 600 W only reduced the count of L. monocytogenes by 1 to 2 logs. Hence, the microwave heating failed to reduce the risk of infection with this pathogen below the level permissible in the EU regulation, especially in the most contaminated samples. In this case, the efficacy of microwave heating was significantly (P < 0.05) affected by the initial count of L. monocytogenes (rho = 0.626), then by meat content in the stuffing (0.476), and to the lowest extent—by the type of meat (0.415 to 0.425). However, no Listeria sp. and L. monocytogenes were isolated from cooked dumplings with fruits (strawberries or blueberries).     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37 ℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100 μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/mL即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限（105 CFU/mL）的10 倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金 试纸条方法的建立

目的 建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法 通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条; 用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测, 验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度, 敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份, 阳性样品1份, 检出率1.53%; 肉制品224份, 阳性样品4份, 检测率1.79%。结论 建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好, 敏感度高, 适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

免疫捕捉PCR和直接PCR技术检测单核细胞增生性李斯特菌比较研究

将免疫学技术与分子生物学技术相结合,建立了免疫捕捉PCR(IC-PCR),并与传统的直接PCR(Direct-PCR)进行比较。结果显示:纯菌液中IC-PCR检测灵敏度(104CFU/mL)是Direct-PCR灵敏度(105CFU/mL)的10倍;模拟带菌实验结果表明:IC-PCR最低可检测到5×101个细菌/PCR反应体系(即104CFU/mL),检测限比Direct-PCR(5×103个细菌/PCR反应体系即106CFU/mL)高100倍;特异性实验、干扰实验结果表明IC-PCR可特异检测单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monaytogenes,LM),而和18株其他常见食源性致病菌无交叉反应。IC-PCR具有快速、经济、灵敏、特异等优点,是一种适合食品安全监管部门、食品企业的LM快速检测方法。     

单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品的 制备与验证

目的研究制备适用于验证、评价实验室或检测机构检测能力的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的能力验证冷冻干燥样品。方法对目标菌与干扰菌进行10倍梯度稀释,对不同稀释度的菌液进行菌落计数得到菌含量,确定单核细胞增生李斯特氏菌与干扰菌的添加量;对保护剂和预冻条件进行筛选优化,制备单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品。冻干样品采用西林瓶真空包装,4℃条件下冷藏保存,随机取样检测评估样品均匀性,并在210 d期间内定期抽样检测不同贮存温度下的冻干样品,检测评估样品的稳定性。结果每个冷冻干燥阳性样品最终添加目标菌单增李斯特菌和干扰菌分别为10~2 CFU/m L和10~4 CFU/m L;每个阴性样品添加干扰菌10~4 CFU/m L;最佳冻干保护剂的组合为海藻糖3%,脱脂奶粉8%,谷氨酸钠1.5%。检测结果显示PT冻干样品具有较好的均匀性和稳定性。结论建立的单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品制备方法与评估程序均为有效,适用于验证与评价实验室或检查机构检测能力,满足能力验证活动的要求。     

数字PCR定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌方法的研究

目的建立微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的分析方法。方法选择基因hly A为靶序列,设计PCR扩增引物和Taq Man探针,优化反应条件和反应体系,通过细菌分离和dd PCR方法对靶标基因的检测特异性、灵敏度和重复性进行实验,并对定量结果进行分析。结果 ddPCR反应中的最佳探针浓度为5 pmol/μL,特异性好,检出限为(3.6±0.1)copies/20μL,重复性实验良好,标准偏差为0.067%。ddPCR的拷贝数(copy number)与细菌密度(colony forming units,CFU/mL)形成了较好的线性关系。结论本研究建立dd PCR的拷贝数和菌液密度或菌落数的线性关系,可以为单核细胞增生李斯特氏菌的快速定量检测提供参考。