实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌

单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌.为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性.结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应.单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml.而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml.人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml.此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查.     

食源性单增李斯特菌的实时定量PCR检测

根据GenBank数据库单增李斯特菌的O基因序列(AF253320)设计引物,建立单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测方法。标准曲线的相关系数为0.996,检出底限约8个细菌/反应,而常规PCR检出底限约60个细菌/反应。比较常规PCR和实时荧光定量PCR对人工污染样品检测,发现实时定量PCR也具有较高的灵敏度;对40份牛奶和40份火腿样品进行检测,阳性率分别为12.5%和10%,与传统细菌分离检测结果完全相符。因此,实时定量PCR检测单增李斯特菌具有快速、灵敏的优点,适宜于食品中单增李斯特菌污染的调查及监测。     

单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立

建立一种可快速检测单增李斯特菌的反转录-环介导等温扩增方法。针对单增李斯特菌的李氏溶血素基因(hly)设计多组引物,经引物筛选和配比优化,建立检测单增李斯特菌的实时荧光RT-LAMP方法,并通过菌株特异性、灵敏度和人工污染脱脂乳样品中的检出限对该方法进行评价。该方法特异性良好, 26株菌株中仅三株单增李斯特菌检出阳性;检测灵敏度高,对单增李斯特菌的菌悬液灵敏度为10~1 CFU/mL,是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。人工污染样品直接检测的检出限为10~3 CFU/mL,而对样品增菌16 h后,单增李斯特菌的检出限提高到10~0 CFU/25 mL。所建立的RT-LAMP方法可以快速、准确地检测单增李斯特菌,操作简便,适合应急和现场监测使用。     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

单核细胞增生李斯特菌质粒DNA参考物质的研制

目的 研制一种能够用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)的质粒DNA标准物质。 方法 设计一种质粒DNA包含目前常用于单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因,并对其稳定性、均匀性和量值可追溯性进行评价。评估其在实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测中的适用性。 结果 质粒DNA参考物质的最终定值结果为29.85 μg/mL。该质粒DNA参考物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20 ℃下保存1年以上。质粒DNA参考品在实时荧光PCR检测中的适用性证明,可以保证实时定量PCR检测结果与单增李斯特菌基因组DNA参考品具有可比性。 结论 研制的质粒DNA标准物质可以替代单增李斯特菌基因组DNA对单增李斯特菌进行质量监控,满足单增李斯特菌检测在实验室质量的有效控制和试验方法验证的需要。 研制一种能够用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)的质粒DNA标准物质。方法 设计一种质粒DNA包含目前常用于单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因,并对其稳定性、均匀性和量值可追溯性进行评价。评估其在实时定量PCR检测中的适用性。结果 质粒DNA参考物质的最终定值结果为29.85 μg/mL。该质粒DNA参考物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20 ℃下保存1年以上。质粒DNA参考品在实时荧光PCR检测中的适用性证明,可以保证实时定量PCR检测结果与单增李斯特菌基因组DNA参考品具有可比性。结论 研制的质粒DNA标准物质可以替代单增李斯特菌基因组DNA对单增李斯特菌进行质量监控,满足单增李斯特菌检测在实验室质量的有效控制和试验方法验证的需要。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。     

食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法建立

根据Genbank提供的沙门氏菌ttrBCA基因序列设计引物和探针,建立了食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法。结果显示,该方法只对沙门氏菌基因呈阳性反应,而对其它常见非阳性菌株(志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、单增李斯特氏菌、阴沟肠杆菌、副溶血性弧菌)基因组DNA均呈阴性反应,对模拟添加沙门氏菌样品检测,检测低限为240cfu/mL沙门氏菌的DNA,检测食品样品增菌液,仅需约3h,结果表明,该方法适用于食品样品的快速检测。     

恒温实时荧光法快速检测不同样品中的单增李斯特菌

为实现乳制品中、临床病人腹泻物中单增李斯特菌的快速检测,选用外引物F3和B3、内引物FIP和BIP作为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,采用便携式荧光恒温扩增仪作为检测平台,选取单增李斯特菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定;选用人工污染的15份乳制品样品和20份腹泻样品进行适用性实验;以上样品同时利用国标法GB4789.30-2010进行菌落计数。结果表明:恒温实时荧光法对纯培养的单增李斯特菌基因组DNA、乳制品和腹泻样品中的单增李斯特菌基因组DNA灵敏度均达到10~2CFU/mL、检测限均达到10~3 CFU/mL;阴性样本出现假阳性的概率分别为0、0.03%和0;单增李斯特菌污染浓度在检出限以上的阳性样本检出率分别为100%、99%和92%。研究表明恒温实时荧光法的检测结果与传统国标培养结果基本一致,恒温实时荧光法适用于乳制品中和临床腹泻样本中单增李斯特菌的快速检测。     

用PCR技术快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

建立了食品中单核细胞增生性李斯特菌快速、敏感、特异的聚合酶链反应PCR检测方法.选择的引物具有良好的单增李氏菌种的特异性.对人工污染在冷冻食品中单增李氏菌的检测低限是4-8CFU/10g,对其增菌液的检测低限是7.2-11×103/ml,每PCR反应体系的检测低限为86-132CFU.对400份自然污染样品的检测结果显示,PCR方法的检测结果同常规培养法的结果完全相符.     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

A PCR method based on 16S rRNA sequence for simultaneous detection of the genus Listeria and the species Listeria monocytogenes in food products

The genus Listeria comprises six closely related species, of which only Listeria monocytogenes is a human pathogen. The rapid and sensitive detection of L. monocytogenes is important in the food industry as well as in medical diagnosis. In this study, a PCR-based method for the rapid, specific, and sensitive detection of L. monocytogenes in food products was developed. The PCR is based on DNA sequences and primer pairs that are found within the 16S subunit of the rRNA gene and are specific to the Listeria genus and to L. monocytogenes within the Listeria genus. The primers for the Listeria genus and for L. monocytogenes were used in the same reaction mix for their simultaneous detection. In addition, a pair of bacterial primers universal to any bacterial DNA at the 16S subunit of the rRNA gene were developed as a positive control. For the detection of Listeria and L. monocytogenes in food products, the method includes selective enrichment for Listeria followed by DNA extraction and a specific PCR reaction. The method detects 1 to 5 CFU in a 25-g sample in < or = 24 h. It can be easily incorporated into the routine screening of diverse food products and readily adapted for clinical use.     

实时荧光HDA法快速检测单核细胞增生李斯特菌

目的：建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增（helicase-dependentisothermal DNA amplification,HDA）快速检测方法。方法：针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10 株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果：实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075 μmol/L,反应温度及反应时间为65 ℃、80 min（40 个循环）,具有良好的特异性和灵敏度。结论：建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。     

食品中单增李斯特菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)是一种广泛存在于自然界中可导致人畜共患病的病原菌, 同时也是一种常见的食源性致病菌。目前, 食品中单增李斯特菌的检测主要采用国标法, 传统检验方法虽然可操作性高, 但检验流程耗时过长。随着生活水平不断提高, 人们在饮食中摄入受单增李斯特菌污染的食品的风险增大, 如遇到食品安全突发事件, 传统检测不能及时得到检测结果, 无法保障人们的饮食安全。本文概述了基于分子生物学和免疫学发展起来的快速检测方法, 包括PCR法、实时荧光定量PCR法、环介导等温扩增法、酶联免疫吸附法、免疫层析试纸条, 其中环介导等温扩增法已经应用于食品致病菌的检测。通过分析对比以上快速检测方法, 为探索更灵敏高效且适用于基层食品检验的检测方法提供参考。     

基于高分辨率溶解曲线分析鉴别食品中的3种李斯特氏菌

本研究利用高分辨率熔解曲线的方法,以iap基因为靶标新设计一对引物同时鉴别单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌,其余14种常见食源性病原微生物扩增为阴性结果,单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌的检出限为10个拷贝,英诺克李斯特氏菌的检测限为50个拷贝。本研究对78份样品进行HRM-realtimePCR法、GB4789.30-2016和SN/T1870-2016(荧光PCR法)的检测,并对3种方法的检测结果进行统计学分析。结果显示:HRM法和国标方法、HRM法和荧光PCR法的检测结果之间存在统计学差异,国标方法和荧光PCR法检测结果之间无统计学差异。本研究建立的基于HRM-real time PCR法检测3种李斯特氏菌的方法快速高效、特异性好、成本低,适用于食品中李斯特氏菌的日常检测和监管。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

重组酶介导扩增技术快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌

目的建立重组酶介导扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方法以单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因作为靶序列,设计引物和探针,通过构建含目的基因片段的重组质粒,评价RAA方法的灵敏度,通过检测沙门氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、副溶血性弧菌核酸、溶血性链球菌核酸、志贺氏菌核酸基因组DNA,评价其特异性。结果建立的RAA方法可在39℃、20 min内,检测重组质粒中hlyA基因片段,最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/反应,且与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、志贺氏菌基因组DNA无交叉反应。结论建立的RAA方法具有灵敏度高和特异性强的特点,可用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。     

Enrichment and DNA extraction protocols for the simultaneous detection of Salmonella and Listeria monocytogenes in raw sausage meat with multiplex real-time PCR

A novel method of DNA extraction and purification was developed and was used in conjunction with a multiplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of Salmonella and Listeria monocytogenes in a raw meat sample. The PCR used primers targeting the invA gene of Salmonella and the hlyA gene of L. monocytogenes, and PCR products were detected with a LightCycler on the basis of fluorescence from SYBR Green and melting temperature. The assay allowed the detection of 3 Listeria cells and 4 Salmonella cells per g of the original sausage within 10 h, including an enrichment period of 6 to 8 h.