hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ的构建及其在PC-3M细胞中的表达

目的：构建人雌激素受体β（hERβ）全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法：采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因（1 593 bp）,与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-hERβ和表达载体pEGFP-C1分别用Hind Ⅲ和BamHⅠ进行双酶切,应用基因重组技术构建hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染PC-3M细胞。结果：重组质粒经限制性酶切鉴定得到与hERβ全长基因长度一致（1 612 bp）的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的hERβ基因（NM_001437）序列完全一致,表明成功地完成了hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达;PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论：构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,hERβ基因在PC-3M细胞内成功表达。     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白-1(LMP-1)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体.方法 用PCR的方法从EB病毒阳性的鼻咽癌组织中调取EB病毒潜伏膜蛋白-1的基因,然后定向克隆到真核表达质粒pEGFP-C3上,以此构建成重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结果 经酶切及测序鉴定,确定已获得重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结论 在增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒中已成功克隆了EB病毒LMP-1基因.     

hERβ全长基因真核表达载体的构建及在PC-3M细胞中的表达

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:RT-PCR法从人卵巢组织钓取hERβ全长基因,序列测定后,应用基因重组技术构建真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经酶切和PCR电泳鉴定后,采用质脂体转染法转染PC-3M细胞。结果:经限制性酶切鉴定和测序分析证实,成功地完成hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达,PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并在PC-3M细胞内成功表达。     

稳定eIF1过表达的鼻咽癌细胞株的构建及其功能研究

目的 构建稳定真核翻译起始因子1(eIF1)过表达的鼻咽癌细胞株,研究其对鼻咽癌细胞增殖和迁徙活性的影响.方法 采用pEGFP-C1真核表达系统,构建eIF1过表达载体,转染鼻咽癌CNE1细胞,进而获得稳定转染细胞株CNE1-eIF1及其对照细胞,以实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证该细胞中eIF1的过表达情况.采用细胞增殖与迁徙实验分别检测CNE1-eIF1细胞增殖和迁徙活性.结果 酶切电泳鉴定及测序检测显示pEGFP-C1-eIF1真核表达载体构建成功.稳定eIF1过表达的鼻咽癌CNE1细胞CNE1-eIF1的eIF1基因和蛋白的表达水平与空载质粒转染相比分别增加2.85倍和2.58倍(P＜0.05),而其增殖和迁徙活性组分别下调55％和36％(P＜0.05).结论 成功构建eIF1过表达鼻咽癌细胞株,eIF1过表达可显著下调鼻咽癌细胞的增殖和迁徙活性,提示其具有潜在的抑癌作用.     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达

目的 构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达.方法 设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白;采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白.结论 成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达.     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的　研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法　用反义LMP1DNA的真核表达载体anti—pcDNA3．1—LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2，G418筛选抗性克隆;Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达；用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞克隆；转染后LMP1蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降，集落形成能力显降低。结论　将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础.方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM 2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况.结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达.结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒.     

紧密连接蛋白claudin-1基因的克隆和大肠癌细胞表达载体的构建

目的 研究claudin-1在大肠癌中的作用,构建包含claudin-1基因编码区域的重组质粒.方法 从人类大肠癌细胞株SW620用Trizol提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得DNA,限制性内切酶进行酶切、T4连接酶进行连接:将PCR产物插入绿色荧光蛋白pEGFP-C1载体,然后转染进人人类大肠癌细胞株SW480.结果 重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示序列正确,在SW480中主要为膜表达.结论 成功构建了claudin-1/pEGFP-C1重组质粒,并能在人类大肠癌细胞中表达.     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX，RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞，G418筛选后，观察和检测转基因细胞的形态学特点，在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化；用pLNSX，pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞，检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比，CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态，相对迁移明显增大（n=3，P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失；随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2，0、6，1．0μg），对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加，呈明显浓度依赖性；LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型，对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一，位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。     

CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的: 构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV⁺)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法: 根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组。采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒。设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC)。采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV⁺肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学。结果: 酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体pIRES2-CSF2A。转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达。MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体。pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV⁺肿瘤细胞48h时凋亡细胞明显增多。结论: 重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV⁺CNE2细胞增殖且促进其凋亡。     

含突变型p53和LMP1双基因重组质粒的构建与鉴定

目的构建一种双基因真核表达载体，使之表达人突变型p53蛋白(p53mt)和EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)，为研究这两个蛋白在鼻咽癌变中的交互作用奠定基础。方法通过基因重组技术，构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt；采用脂质体LipofectAMINE^TM 2000将此载体转入体外培养的HeLa细胞中，转染后48h，采用免疫细胞化学方法分析突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达。结果对重组载体进行限制性内切酶酶切及PCR鉴定分析，结果与预期相符合：转染试验观察到转染细胞中突变型p53基因和LMP1基因的阳性表达。结论成功构建了表达人突变型p53蛋白和EB病毒LMP1的真核载体pLMP1-p53mt，其研究思路可以为中医体质病机研究提供借鉴。     

人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建含人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22的真核表达载体,并观察其在直肠癌细胞(rectal cancer cells,CMT-93)中的表达.方法:将目的基因G22克隆入真核质粒pcDNA3.1( )中构建真核表达载体pcDNA3.1( )-G22,并进行酶切鉴定和DNA序列测定.用脂质体法将重组质粒转染入CMT-93细胞,以Western免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光检测G22基因的表达.结果:酶切鉴定和DNA序列分析证实,重组质粒pcDNA3.1( )-G22含有人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22的全长序列,转染实验表明G22基因能在真核细胞CMT-93中正确表达.结论:人源性鼻咽癌抗独特型抗体基因G22真核表达载体构建及其在CMT-93细胞中的表达均获成功,为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。