Epstein—Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

目的：探讨EBV－LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果。方法：将已构建的EBV LMP1基因（EBV LMP1）重组质粒pcDNA3－BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBV LMP1抗体滴度、CD4^ /CD8^ T淋巴 细胞亚群的数量变化以及EBV LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照。结果：重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBV LMP1抗体;其脾细胞中CD4^ /CD8^ T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBV LMP1特异性的CTL存在。以上结果在免疫16周之内无明显改变。结论：EBV－LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗。     

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的 构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A（LMP2A）编码基因和即刻早期基因（BZLF1）融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头（Gly4Ser）3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。     

ED-L2-LMP1-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建及鉴定EB病毒LMP1基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体。方法应用DNA重组技术，将EB病毒ED-12启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上，筛选阳性克隆，经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后，以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8．9、包膜基因VSVG和带目的基因ED-12-LMP1-EGFP载体共同转染到293FF包装细胞内包装病毒，荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况，收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度。PCR和免疫组化鉴定LMP1表达。结果融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782bp的ED-12和1300bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒载体中。转染重组ED-12-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光；对该细胞PCR可以扩增出404bp大小的LMP1基因片段和370bp的EGFP基因片断；免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性。结论成功构建了ED-12-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体，为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A1-119重组质粒的表达及鉴定

目的：构建含EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）潜伏膜蛋白（LMP）2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法：采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果：pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论：EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。     

埃泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白2A特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导研究

目的：利用含埃泼斯坦-巴尔病毒(Epstein—Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒(rVV—LMP2A)感染的人树突状细胞(DC)体外诱导EBV—LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法：rVV—LMP2A感染的DC分别在培养第1、8天刺激相同MHC背景的人外周血单个核细胞(PBMC)，在IL-2作用下体外诱导EBV特异性CTL。培养第15天乳酸脱氢酶法检测CTL的特异性杀伤活性。结果：诱导的CTL对rVV—LMP2A感染的靶细胞在效靶比为5：1、10：1和15：1时，特异性杀伤率分别为63．5％、65．5％和67．9％。结论：rVV—LMP2A感染的DC刺激相同MHC背景的PBMC可诱导出较高杀伤活性的EBV特异性CTL。     

融合基因EBNA1-LMP1重组腺病毒的构建及其免疫学研究

目的 构建EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)EBNA1和LMP1融合基因的重组腺病毒,探究重组腺病毒的免疫学作用.方法 以质粒pCXWB-EBNA1和pMV261-LMP1为模板,通过PCR扩增EBNA1和LMP1基因,并通过linker以重叠延伸PCR的方式构建融合基因EBNA1-LMP1,将其...     

ED-L2-LMPl-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鏊定EB病毒LMPl基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体.方法 应用DNA重组技术,将EB病毒ED-L2启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上,筛选阳性克隆,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后,以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和带目的 基因ED-L2-LMP1-EGFP载体共同转染到293FT包装细胞内包装病毒,荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况,收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度.PCR和免疫组化鉴定LMP1表达.结果 融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782 bp的ED-L2和1 300 bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒栽体中.转染重组ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光;对该细胞PCR可以扩增出404 bp大小的LMP1基因片段和370 bp的EGFP基因片断;免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性.结论 成功构建了ED-L2-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体,为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础.     

细菌—酵母穿梭表达质粒pGBKT7—LMP1的构建与鉴定

目的 构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1（LMP1）的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1。方法 RT－PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段，利用DNA重组技术将其定向插入细菌－酵母穿梭质粒pGBKT7启动子下游。结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT－PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合；LMP1准确克隆入pGBKT7的多克隆位点，未改变读码框架。结论 成功构建了穿质粒pGBKT7-LMP1。     

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro-2A，脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

Epstein-Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

[目的]探讨EBV-LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果.[方法]将已构建的EBVLMP1基因(EBVLMP1)重组质粒pcDNA3-BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBVLMP1抗体滴度、CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的数量变化以及EBVLMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性.用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照.[结果]重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBVLMP1抗体;其脾细胞中CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBVLMP1特异性的CTL存在.以上结果在免疫16周之内无明显改变.[结论]EBV-LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗.     

脱氧核酶对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1增殖和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)基因特异性的脱氧核梅(DNAzyme)对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1的增殖和凋亡的影响。方法:设计合成针对EBV-LMP1基因的DNAzyme(DZ1),在P3HR-1细胞上观察其对细胞增殖活性、细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:脱氧核酶DZ1作用于P3HR-1细胞后,可显著抑制EBV-LMP1基因的表达,并呈剂量依赖性。将脱氧核酶DZ1抑制LMP1的表达,进而下调抗凋亡蛋白Bc1-2的表达,诱导细胞色素c释放,从而诱导细胞凋亡。结论:在P3HR-1细胞中,靶向LMP1可能成为潜在的基因治疗的分子靶,靶向LMP1的脱氧核酶可能成为EB病毒相关肿瘤基因治疗实验研究的新的工具。     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1 的构建与鉴定

[目的]构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1(LMPl)的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1.[方法]RT-PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段,利用DNA重组技术将其定向插人细菌-酵母穿梭质粒pGBKT7的T7启动子下游.[结果]限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克隆人pGBKT7的多克隆位点,未改变读码框架.[结论]成功构建了穿梭质粒pGBKT7-LMP1.     

CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的: 构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV⁺)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法: 根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组。采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒。设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC)。采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV⁺肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学。结果: 酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体pIRES2-CSF2A。转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达。MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体。pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV⁺肿瘤细胞48h时凋亡细胞明显增多。结论: 重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV⁺CNE2细胞增殖且促进其凋亡。     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

目的: 制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒. 方法: 采用RT- PCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGW中. 经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体. 在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-LMP1导入病毒包装细胞293FT, 荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,PCR鉴定. 结果: 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合; LMP1准确克隆入FUGW的多克隆位点. 慢病毒的3种质粒可高效转染入293FT细胞,荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光. 绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质. 结论: 成功制备了LMP1与GFP融合基因慢病毒,为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.     

LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白-1(LMP-1)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体.方法 用PCR的方法从EB病毒阳性的鼻咽癌组织中调取EB病毒潜伏膜蛋白-1的基因,然后定向克隆到真核表达质粒pEGFP-C3上,以此构建成重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结果 经酶切及测序鉴定,确定已获得重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结论 在增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒中已成功克隆了EB病毒LMP-1基因.     

ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１胞外区融合蛋白的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)胞外肽段与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并用该融合表达蛋白检测EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者血清中的特异性抗体.方法:用BamH I和EcoR I将含LMP1胞外区重组基因的质粒pMD18-LMPI双酶切后,克隆到pGEx4T-2中.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经谷胱甘肽S-转移酶柱亲和层析纯化,纯化的蛋白经Westemblot法检测鉴定.结果:重组表达质粒经酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为32.2 ku,此抗原能够与鼻咽癌患者血清中抗体特异性结合.结论:成功获得了LMP1胞外区重组基因表达的蛋白,并证明原核表达的LMP1胞外肽段保持了原有的抗原性,能够与EBV相关鼻咽癌患者血清中的抗体特异性结合.     

EB病毒融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cD-NA,采用剪接式重叠延伸(spliced overlap exetension,SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。