运用PCR-DGGE技术分析贵州侗族酸肉中细菌多样性

应用PCR-DGGE技术研究贵州侗族发酵肉中的细菌群落结构及其品种间的多样性差异。结果表明:酸肉中的优势菌群差异不明显,3个样品中共检测到21种菌,共4个属,分别是葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)和四联球菌属(Tetraggenococcus)。另还发现两种不可培养细菌uncultured 1和uncultured 2。     

黄酒熟麦曲中细菌多样性的评价

以黄酒熟麦曲为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chan reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)与MiSeq高通量测序技术相结合的方法对其细菌多样性进行解析。DGGE结果表明:Bacillus(芽孢杆菌)、Weissella(魏斯氏菌)、Pediococcus(片球菌)、Staphylococcus(葡萄球菌)和Lactobacillus(乳酸杆菌)普遍存在于麦曲样品中。MiSeq高通量测序结果表明:熟麦曲中的细菌门主要为Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria,平均相对含量分别为87.95%、9.00%和1.16%。熟麦曲中的细菌属主要为Bacillus (芽孢杆菌属)、Weissella(魏斯氏属)、Staphylococcus(葡萄球菌)、Klebsiella(克雷伯菌属)、Pantoea(泛菌属)和Lactobacillus(乳杆菌属),其平均相对含量分别为70.70%、8.55%、2.67%、2.29%、1.32%和1.07%。由此可见,Bacillus(芽孢杆菌)为熟麦曲中的优势细菌。     

市售卤牛肉中腐败菌的分离鉴定

为了有针对性地控制本地市售卤牛肉中微生物污染,延长产品货架期,采用平板划线分离法对卤牛肉中的优势腐败菌进行分离筛选。再采用传统微生物培养方法,根据细菌的菌落形态、菌体形态、革兰氏染色等特征,结合16S rDNA序列分析方法,对分离筛选出的菌株进行鉴定。结果表明,引起本地市售卤牛肉腐败变质的优势腐败菌是魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)和佐氏库特氏菌(Kurthia zopfii)。     

Illumina MiSeq高通量测序分析红谷黄酒酒曲微生物菌群多样性

采用南阳红谷黄酒酒曲为研究对象,利用高通量测序方法对红曲、大曲、小曲的微生物菌群多样性进行分析。结果表明,大曲的微生物菌群多样性最高,红曲的最低,且两者间的微生物群落结构差异最大。红曲中优势细菌属为伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）等,优势真菌种为紫红曲霉（Monascus purpureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）等;大曲中优势细菌属为克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）等,优势真菌种为嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）等;小曲中优势细菌属为魏斯氏菌属、乳球菌属（Lactococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）等,优势真菌种为少根根霉菌（Rhizopus arhizus）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等。     

苗族酸酢鱼发酵过程中微生物群落、氨基酸及水分动态变化规律

利用Illumina HiSeq测序及低场核磁技术,针对苗族酸酢鱼发酵过程中的品质变化规律进行研究。结果表明,乳酸杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）和葡萄球菌属（Staphylococcus）是发酵中的优势菌属。发酵至第24天时,酸酢鱼发酵菌群中葡萄球菌属相对丰度最高,达到64.65%,其次为四联球菌属（Tetragenococcus）、乳杆菌属、巨球菌属（Macrococcus）和魏斯氏菌属。发酵成熟（第24天）的酸酢鱼中总游离氨基酸含量从380.61 mg/100 g增加到1 406.09 mg/100 g,呈味氨基酸有天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）,Glu的味道强度值为30.69,对贵州酸酢鱼的整体滋味贡献最为显著。鱼肉中的不易流动水和自由水的含量显著下降,结合水相对含量逐渐上升,该变化与鱼肉质构变化规律一致。本实验为我国民族特色水产食品的工业化开发提供了一定理论支持。     

基于高通量测序技术分析豆腐乳中微生物多样性

采用高通量测序技术对4种不同来源发酵豆腐乳中微生物的多样性和丰度进行比对分析。结果表明,纯种发酵与自然发酵豆腐乳样品微生物菌群多样性差异较大,从不同豆腐乳样品中共检测得到3个优势细菌门（平均相对丰度＞1%）、6个优势真菌门、13个优势细菌属和19个优势真菌属;共有优势细菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、魏斯氏菌属（Weissella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和明串珠菌属（Leuconostoc）,其中,假单胞菌属在自然发酵豆腐乳中平均相对丰度最高（62.05%）;共有优势真菌属为酵母属（Saccharomyces）、曲霉属（Aspergillus）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）、短梗霉属（Aureobasidium）、假丝酵母属（Candida）和有孢圆酵母属（Torulaspora）,其中酵母属在纯种发酵豆腐乳中平均相对丰度最高（44.42%）。     

宜昌腊肠与恩施腊肠细菌多样性的比较分析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对宜昌腊肠细菌多样性进行解析,并与之前报道的恩施腊肠细菌群落结构进行比较分析。结果表明：宜昌腊肠在门水平主要由厚壁菌门（Firmicutes,64.93%）、变形菌门（Proteobacteria,32.12%）和放线菌门（Actinobacteria,1.14%）组成;在属水平上,主要由葡萄球菌属（Staphylococcus,16.57%）、乳酸杆菌属（Lactobacillus,16.22%）、魏斯氏菌属（Weissella,14.67%）和明串珠菌属（Leuconostoc,11.43%）等组成。宜昌腊肠细菌丰度显著低于恩施腊肠（P＜0.05）,且2 个地区腊肠的细菌菌群结构存在较大差异。基因功能预测结果表明,宜昌腊肠中细菌在碳水化合物代谢和多糖的生物合成与代谢等方面更加旺盛,这些差异与腊肠中乳酸杆菌的相对丰度存在显著相关性。     

合成菌群的构建及其对发酵香肠风味的改良效果

以自然发酵香肠为研究对象,通过分析其细菌群落优势菌属（相对丰度＞1%）、共现菌属（Spearman相关性系数|ρ|＞0.5,P＜0.05）,以及与挥发性风味物质显著相关（P＜0.05）的菌属,确定出调控自然发酵香肠典型风味的核心菌群,据此构建合成菌群,与进口商业发酵剂发酵香肠进行对比,分析合成菌群对发酵香肠感官和风味的改良效果。结果表明：自然发酵香肠的核心菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链球菌属（Streptococcus）,以上述菌属对应的代表性菌种清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）构建的合成菌群制备改良发酵香肠,其感官特性及风味明显优于商业发酵剂制备发酵香肠,具体表现为：前者的清新味和甜香味较为明显,酸味、咸味和金属异味较淡,特别是具有潜在清新味和果香味的醛类和芳香烃类物质含量显著高于后者（P＜0.05）。     

山西陈醋发酵过程微生物群落动态分析及差异菌属筛选

本研究利用高通量测序对山西陈醋发酵过程中的微生物群落组成进行了探讨,并分析了酒精发酵和醋酸发酵这两大发酵阶段的菌群变化。结果表明,对于细菌群落结构,醋曲（R1）、酒精发酵阶段（R2）和醋酸发酵阶段（R3）中的主要菌门为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）,R1中的主要优势菌属为魏斯氏菌属（Weissella）,R2中主要优势菌属起初为魏斯氏菌属（Weissella）,发酵后期逐渐乳杆菌属（Lactobacillus）占优势,R3中占绝对优势的菌属由最初的乳杆菌属（Lactobacillus）转变为醋杆菌属（Acetobacter）,对于真菌群落结构,R1、R2和R3中的主要菌门为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）,R1中的主要优势菌属为伊萨酵母属（Issatchenkia）,曲霉属（Aspergilus）和米勒酵母属（Millerozyma）,R2中处于绝对优势菌属为伊萨酵母属（Issatchenkia）,且在此阶段呈上升趋势,R3中伊萨酵母属（Issatchenkia）仍然是主要菌属,在此阶段呈现出先上升后下降的趋势,相对丰度最高达到81.3%。R2与R3有6个显著差异菌属,分别为葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、土芽孢杆菌属（Geobacillus）和曲霉属（Aspergillus）。综上,山西陈醋不同发酵阶段的微生物群落结构具有差异性,并随着发酵进行不断变化。     

应用Illumina MiSeq高通量测序技术解析梅干菜中细菌多样性

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对恩施地区梅干菜中细菌多样性进行解析,同时使用传统纯培养技术对乳酸菌进行分离鉴定。结果表明,恩施地区梅干菜中含量最高的优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes）,其平均相对含量高达60.70%。优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、四联球菌属（Tetragenococcus）和棒状杆菌属（Corynebacterium）,其平均相对含量分别为60.50%、8.69%、2.86%、1.73%、1.28%、1.07%、1.03%、1.00%。采用传统培养方法从梅干菜分离出5种共12株乳酸菌,经分子生物学鉴定分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）,副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、食品乳杆菌（Lactobacillus alimentarius）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。恩施地区梅干菜中的细菌主要以乳酸菌为主,且乳酸杆菌多样性较高。     

Spoilage of blood sausages morcilla de Burgos treated with high hydrostatic pressure

In this study, the microbial ecology of the blood sausage morcilla de Burgos, subjected to high hydrostatic pressure treatment (HPP), was studied by culture-dependent and -independent methods. Morcilla de Burgos is the most traditional and famous blood sausage in Spain. The producers are interested in extending its shelf-life in order to expand their market and to reduce losses attributed to spoilage. Sausage batter prior to stuffing and blood sausages HPP treated or not (control) were analyzed at 0, 9, 14, 21, 28 and 35 days of storage at 4 degrees C. Lactic acid bacteria, Pseudomonas spp. and aerobic mesophilic bacteria were investigated by traditional plating. PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was used to analyze the DNA and the RNA extracted directly from the blood sausages, as well as bulk cells of LAB and Pseudomonas spp. The results showed that HPP improved the shelf life of morcilla de Burgos to 28 days in comparison with control samples. The populations responsible for spoilage, namely LAB, remained lower in HPP treated samples when compared with the control samples. Only at 35 days of storage they reached values of 10(8) cfu/g, leading to the spoilage of the product. Although, HPP affected the LAB population, they were able to recover the injury provoked by the treatment. Lastly, HPP seemed to affect differently LAB species detected. While Leuconostoc mesenteroides was completely inactivated by HPP, Weissella viridescens was able to recover and carry out the typical spoilage of the product. Pseudomonas spp. remained under detection level (<10(2) CFU/g) after the HPP treatment.     

基于高通量测序分析虾夷扇贝柱菌群结构及腐败优势菌

为揭示虾夷扇贝柱的菌群结构及腐败优势菌,通过对宏基因组DNA进行高通量测序,分析虾夷扇贝柱新鲜和腐败样品的菌群结构,同时对可培养细菌菌群基因组DNA进行高通量测序,分析新鲜和腐败样品可培养细菌菌群的结构特征。结果表明,对宏基因组测序后获得的新鲜虾夷扇贝柱中细菌菌群多样性丰富,其中相对丰度较高的有Candidatus kuenenia（10.73%）、弧菌属（Vibrio,8.15%）、别弧菌属（Aliivibrio,7.38%）、芽孢杆菌属（Bacillus,7.20%）和未分类菌（unclassified,16.08%）;4?℃的腐败优势菌为发光杆菌属（Photobacterium,46.91%）、别弧菌属（36.82%）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas,11.01%）,15?℃的腐败优势菌为发光杆菌属（46.97%）和别弧菌属（43.33%）,25?℃的腐败优势菌为发光杆菌属（41.94%）、别弧菌属（23.10%）、梭杆菌属（Fusobacterium,18.61%）和乳酸菌属（Lactobacillus,10.60%）。对可培养细菌菌群基因组测序后发现,新鲜样品可培养细菌菌群多样性大大降低,大部分为假交替单胞菌属（89.46%）,在25?℃腐败后,可培养的腐败优势菌为弧菌属（50.98%）、希瓦氏菌属（Shewanella,17.43%）和乳酸菌属（10.68%）。本研究揭示了虾夷扇贝柱新鲜及腐败样品的菌群结构特征及腐败优势菌,为进一步研究微生物对虾夷扇贝柱品质劣化的作用机制提供一定参考。     

新疆椒麻鸡中腐败细菌的分离与鉴定

为研究新疆椒麻鸡中腐败细菌的种类和特性,采用平板划线法分离腐败菌。利用生理生化实验和16S rDNA序列分析方法,对从椒麻鸡中分离的31 株腐败菌进行鉴定。结果表明：所筛选的31 株菌中,肠杆菌20 株、葡萄球菌3 株、气单胞菌2 株、乳酸菌4 株、溶酪大球菌2 株;新鲜椒麻鸡中的主要腐败菌为溶酪大球菌、葡萄球菌和肠杆菌;低温5 ℃贮藏条件下腐败样品中的主要腐败菌为乳酸菌、葡萄球菌和肠杆菌;常温25 ℃贮藏条件下腐败椒麻鸡中的腐败菌主要为肠杆菌、气单胞菌、葡萄球菌和乳杆菌。     

盐浓度对自制香肠理化因子及原核微生物群落多样性的影响

为研究盐浓度对香肠发酵的影响，采用16S rRNA测序和理化分析技术，对不同盐度下发酵的自制香肠中微生物多样性和物理化学特性进行研究。结果表明，盐浓度可以显著影响pH、水分含量及过氧化值，并且也会显著影响微生物的多样性和组成。乳杆菌属（Lactobacillus）在香肠发酵中占优势，其相对丰度在30.29%～58.15%范围之间，明串珠菌属（Leuconostoc）、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、魏斯氏菌属（Weissella）、盐单胞菌属（Halomonas）、片球菌属（Pediococcus）、盐弧菌属（Salinivibrio）和四联球菌属（Tetragenococcus）受盐度的影响显著。冗余分析（RDA）结果表明，盐度对菌群的影响最大。综上所述，添加4%食盐的香肠具有更高的乳酸菌相对丰度（58.15%）。该结果有助于了解加盐对香肠发酵微生态的影响，为香肠的质量控制提供依据。     

超高压处理抑制低温烟熏火腿中的优势腐败菌

研究尝试应用微生物菌体总RNA提取代替DNA提取,进而通过反转录-PCR( RT-PCR),结合变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术,以期揭示超高压处理后低温烟熏火腿中腐败微生物的存活情况,探索RNA-DGGE手段判定超高压处理后微生物存活状态的可行性.分别以400 MPa和600 MPa的压力在室温(22℃)条件下,对包装后的烟熏火腿进行10 min超高压处理,未经高压处理样品作对照,于4℃冷藏条件下,贮藏1、15、30、60、90 d,直接提取样品中微生物的总RNA,对其进行RT-PCR和DGGE指纹图谱分析.DGGE指纹图谱显示,超高压处理对烟熏火腿中的优势腐败菌具有较强的抑制作用,且随压力的升高抑菌效应增强;超高压处理后烟熏火腿微生物种群结构变得单一,Weissella viridescens和Leuconostoc mesenteroides是超高压处理后烟熏火腿中的优势腐败菌.基于菌体总RNA提取的DGGE手段能够有效检测超高压处理后微生物的存活状况,揭示超高压对低温烟熏火腿中优势腐败微生物的抑菌效果.     

Characterisation of microbial deep spoilage in Iberian dry-cured ham

The purpose of this work was to investigate the micro-organisms involved in overlooked “bone taint” spoilage of dry-cured Iberian hams. The physico-chemical characteristics of spoiled hams with 12 and 24 months of ripening, showing initial signs of alteration, were analyzed and their correlations with microbial counts studied. The spoilage potential of different microbial groups was assessed by the relationship between the microbial counts and the proteolysis level of spoilage as observed in the degradation of myofribrillar and sarcoplasmic protein fractions and in the changes in free amino acids. Non-enteric gram-negative bacteria (NEGN) were the dominant microbial group, showing a positive correlation with the moisture of spoiled hams. The Catalase-positive cocci (GPCP) growth was favoured by high NaCl concentrations in the spoiled hams, whereas the counts of Enterobacteriaceae were negatively affected by high NaCl concentration. The highest proteolytic microorganisms were the Gram-negative microbial groups playing Enterobacteriaceae a major role in the undesirable changes of the texture properties of the spoiled hams. With respect to the sensorial analysis, a synergy between NEGN and GPCP was observed in most of the strongly spoiled samples.     

腊肠发酵过程中细菌多样性评价及其对风味的影响

采用电子鼻对不同发酵时间腊肠风味品质进行评价,并采用MiSeq高通量测序技术对细菌多样性进行解析,同时对细菌的代谢功能进行预测,最终对细菌多样性与风味品质和代谢通路进行关联分析。结果发现在发酵到10 d左右,腊肠的风味品质发生了明显的变化,发酵初期是腊肠风味品质形成的关键时期。在门水平上,厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）平均相对含量之和高达96.00%。在属水平上,主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和魏斯氏菌属（Weissella）等乳酸菌。经基因功能预测和相关性分析发现,乳酸菌对腊肠的发酵成熟和风味品质的形成有至关重要的作用。同时,研究表明发酵时间控制在10 d左右,所得的腊肠品质较好。     

Characterization and identification of lactic acid bacteria in "morcilla de Burgos"

A total of 176 lactic acid bacteria (LAB) isolated from a typical Spanish blood sausage called "morcilla de Burgos" were identified by means of phenotypic characteristics and 16S rDNA RFLP (ribotyping). LAB were isolated from "morcilla" of different producers and in different storage periods, which includes unpackaged, vacuum and modified atmosphere packaged "morcilla" and vacuum packed and pasteurised "morcilla". The knowledge of specific spoilage bacteria of "morcilla de Burgos" will be useful to design new preservation methods to extend the shelf-life of this product. Identification made according to phenotypic and biochemical characteristics shows the majority of the isolates were heterofermentative LAB (93.2%) and eight different bacterial groups could be distinguished (A-G). Weisella viridescens was the main species detected (42%). In addition, Leuconostoc spp. (23.9%), Weissella confusa (11.4%) and Lactobacillus fructosus (5.7%) species were found. Few strains were phenotypically misidentified as Lactobacillus sanfrancisco, Pediococcus spp., Lactobacillus sakei/curvatus and Carnobacterium spp. and 11 strains remained unknown. Most of the leuconostocs were identified as Leuconostoc mesenteroides and Leuconostoc carnosum species. Ribotyping shows a quite good correlation with phenotypic methods, although it has been possible to identify 15 different clusters. W. viridescens and leuconostocs were also the predominant LAB. Strains identified as W. confusa by phenotypic characteristics were resolved in W. confusa and Weissella cibaria by ribotyping. Neither Carnobacterium piscicola nor Lb. sanfrancisco were identified by means of genotypic method. All Lb. fructosus strains and some more included in different phenotypic groups (17 strains in total) could not be associated with any reference strain (cluster VII).     

基于高通量测序的南美白对虾中微生物群落分析

目的：分析不同状态下南美白对虾表面附着的微生物菌群组成情况。方法：以活体对虾、冰鲜对虾、冰鲜虾仁和冷冻虾仁为对象,通过对虾表面附着微生物提取及高通量测序分析,获得不同对虾样品中微生物组成及变化情况。结果：1）各样本有效序列范围为30?591～42?043?条、操作分类单元（operational taxonomic units,OTU）范围为68～168,其中冷冻虾仁OTU数量最低,而活体对虾和冰鲜对虾OTU数量相对较高。2）多样性指数分析发现,所有样品中以冷冻虾仁的ACE、Chao1和Shannon指数值最低、Simpson指数最高,表明其菌群丰度及多样性较低。3）在科水平上,相比于活体对虾,冰鲜对虾中莫拉氏菌科（Moraxellaceae）相对丰度显著增加,其可能与虾体死亡、微生物污染繁殖有关;冰鲜虾仁弧菌科（Vibrionaceae）相对丰度显著增加且含量最高,主要是虾仁加工制备环境及加工器具中微生物接触污染所致;而冷冻虾仁中主要以莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、李斯特菌科（Listeriaceae）为腐败优势菌。4）热图分析发现,活体对虾和冰鲜对虾菌群结构整体相似度较高,二者与冰鲜虾仁、冷冻虾仁的相似度较低,表明虾仁制备过程、低温冻藏对于虾仁中菌群结构影响较大。5）主成分分析表明,冷冻虾仁与其他组别样本均相距较远,说明冷冻虾仁中微生物种类及组成与其他样品存在着较大差异。结论：南美白对虾样品处于不同状态时,其附着优势微生物、菌群结构、丰度及相互比例等存在显著差异,需针对于不同类型虾类制品,采取不同的控制工艺以保障虾类制品的质量与安全。