老年人肠道乳酸菌的分离与鉴定及其来源发酵乳杆菌的遗传进化分析

首先对湖北襄阳和恩施地区的健康老年人肠道乳酸菌进行分离与鉴定，然后从中选择发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）进行多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）分析。结果显示，基于可培养方法，湖北襄阳与恩施地区老年人肠道乳酸菌可以鉴定为以乳杆菌属（Lactobacillus）为主的5 个菌属，15 个种。总的来说，发酵乳杆菌和唾液乳杆菌（L. salivarius）占老年人肠道源乳酸菌分离株总量的55%左右，表明人体肠道可以作为发酵乳杆菌的重要分离来源。基于8 个持家基因的MLST分析表明，25 株来源于肠道的发酵乳杆菌可以划分为25 个序列型，具有极高的遗传多样性；基于选择压力分析与phi-test，选用的8 个持家基因均受到纯化选择作用，且其中仅基因rpoB显著经历了基因重组事件；另外，基于Prim’s和goeBURST的进化分析表明，一半左右的肠道源发酵乳杆菌倾向于形成单独的分支，表明它们具有一定的宿主特异性，可能的原因是为适应肠道环境，这些发酵乳杆菌经历了有异于发酵食品生境的进化历程。     

基于PacBio SMRT技术的婴幼儿配方奶粉微生物安全性评价

目的:婴幼儿配方奶粉中的大量细菌已被灭活,然而灭活微生物仍影响产品品质和货架期。现行纯培养技术只能对食品基质中活菌进行检测,无法全面评估污染微生物组成,而基于宏基因组学策略能够对婴幼儿配方奶粉加工过程中污染微生物进行全面客观的评价。方法:采集6份婴幼儿配方奶粉,使用细菌纯培养、单分子实时测序技术(PacBio SMRT)和微滴式数字PCR(ddPCR)联用技术对其污染微生物组成进行评价。结果:采用纯培养技术在样品中均未检测到大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌和芽孢。使用PacBio SMRT测序技术,在婴幼儿配方奶粉中共鉴定出14个细菌门、138个细菌属和255个细菌种。其中6份样品均存在过嗜冷菌蜡样芽孢杆菌,其平均相对含量高达23.54%,这一灭活的细菌也会影响产品货架期。此外,在IF3、IF4、IF5和IF6样品中,检测到相对含量较低的致病菌大肠杆菌,其相对含量分别为0.06%,0.01%,0.15%和0.05%。采用ddPCR技术对SMRT测序方法检测到的致病菌蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌进行定量分析,发现每克奶粉样品中蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌的平均拷贝数取对数后分别为5.45和4.89。结论:在6份婴幼儿配方奶粉中均未检出致病菌,符合食品安全国家标准,然而奶粉中被灭活的蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌可能增加产品腐败的风险,影响产品的货架期。本研究结合多个技术全面评价婴幼儿配方奶粉的微生物污染情况,初步建立婴幼儿配方奶粉的微生物检测技术。     

糯米酸细菌多样性解析及其表型和基因功能预测

本研究在采用MiSeq高通量测序技术对糯米酸中细菌多样性进行解析的基础上,进一步对细菌表型和基因功能进行了预测。结果发现,糯米酸的细菌类群主要为隶属于Firmicutes(硬壁菌门,97.45%)的Lactobacillus(乳酸杆菌属,89.36%)和Pediococcus(片球菌属,6.37%)。有5 个分类操作单元存在于所有样品中,均被鉴定为Lactobacillus,累计平均相对含量为10.27%。表型预测表明,糯米酸中细菌类群主要为革兰氏阳性的厌氧菌和兼性厌氧菌,具有移动原件、生物膜形成能力和致病潜力的菌群相对含量均较低。基因功能预测表明,细菌类群在氨基酸转运与代谢、碳水化合物运输与代谢等功能上具有较高的表达。由此可见,糯米酸中蕴含了较为丰富的乳酸菌资源。     

市售茨河花色腐乳和红方腐乳微生物菌群及风味物质的比较分析

基于MiSeq高通量测序技术对湖北省谷城市茨河花色腐乳和全国不同地区的红方腐乳的微生物菌群进行了分析,同时使用GC-IMS对腐乳的气味基础—挥发性有机物进行了分析。结果表明,花色腐乳与红方腐乳的细菌与真菌菌群结构存在显著差异(P<0.05),前者的生物标志菌属为假单胞菌属(Pseudomonas),而红方腐乳的生物标志菌属为红酵母属(Rhodotorula),曲霉属(Aspergillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。GC-IMS结果显示,两种腐乳的小分子酯类风味物质种类最丰富,醛类物质在红方腐乳中富集,而酮类物质在花色腐乳中富集。另外,红方腐乳的特征风味物质为乙醇、2-甲基丁醛,2-甲基异丙醛等,而花色腐乳的特征风味物质为乙醛,丙烯酸乙酯,柠檬烯等。另外,威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和毛霉(Mucor)与多种风味物质呈正相关,因此在花色腐乳的生产中具有开发与应用的潜力。     

建始地区酸豇豆盐水细菌多样性及乳酸菌分离鉴定

该研究采用MiSeq高通量测序技术对酸豇豆盐水的细菌多样性进行了解析,并通过纯培养方式分离了其中的乳酸菌。结果发现,细菌以硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为主,平均相对含量分别为84.41%和10.52%;细菌属以乳酸杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和片球菌属（Pediococcus）为主,平均相对含量分别为57.02%、9.33%、7.07%、4.73%和3.40%;发现44个操作分类单元（OTU）存在于所有样品中,所包括序列占总序列数的25.06%,其中有6个、11个和13个分别被鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）、魏斯氏菌属（Weissella）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）,所含序列平均含量分别为4.61%、4.97%和14.46%;通过纯培养共分离出了13株乳酸菌,其中12株被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。由此可见,乳酸杆菌为建始地区酸豇豆盐水中的优势细菌,且乳酸杆菌主要为植物乳杆菌。     

扣囊复膜酵母在红枣酒中的应用

采用纯培养技术对10个采集自大竹县东柳乡的米酒曲样品蕴含的酵母菌进行分离鉴定,结果表明,24株酵母菌中16株被鉴定为Saccharomycopsis fibuligera(扣囊复膜酵母),S.fibuligera为米酒曲中的优势酵母菌。选取S.fibuligera分离株制备红枣酒并对其品质进行评价,结果发现红枣酒酒精度在8.1%vol~11.9%vol,可溶性固形物含量在7.59%~17.21%。色度仪结果表明,红枣酒颜色整体偏红偏黄。电子鼻结果表明,乙醇为红枣酒挥发性化合物的主要成分。电子舌结果表明,红枣酒在酸味指标上差异最大,相对强度的极差值为4.48。主成分分析结果表明,S.fibuligera HBUAS61136酿造的红枣酒具有较好的风味品质和较高的酒精度。     

不同地区米酒曲细菌多样性解析及表型预测

以广西省南宁地区和湖北省孝感地区的米酒曲为研究对象,在采用Illumina MiSeq高通量测序技术对其16S rRNA V₃~V₄区进行测序的基础上,结合生物信息学和多元统计学手段对2个地区米酒曲细菌多样性进行了解析,同时对其细菌类群表型进行了预测。结果表明:南宁地区米酒曲细菌类群的香农指数显著低于孝感地区（P<0.05）;基于加权UniFrac距离的主坐标分析显示2个地区样本在空间排布上呈现明显的分离趋势;多元方差分析结果表明2个地区米酒曲细菌群落结构差异显著（P<0.05）;南宁地区米酒曲细菌类群以Lactobacillus（乳杆菌属）为主,平均相对含量为62.03%,而孝感地区以Weissella（魏斯氏菌属）为主,平均相对含量为50.14%。表型预测结果表明,南宁地区米酒曲中革兰氏阳性菌含量高度显著偏高（P<0.01）,而细菌类群的氧化胁迫耐受、生物膜形成、革兰氏阴性、致病潜力和兼性厌氧特性高度显著偏低（P<0.01）。由此可见,不同地区米酒曲的细菌类群存在一定的差异。     

基于仿生学技术不同发酵方式酸浆水品质评价

为比较研究纯种发酵与加引子发酵酸浆水品质差异,本研究分别采用发酵乳杆菌纯种发酵和以老卤水为引子发酵两种方式制作酸浆水,并使用电子舌、电子鼻和色度仪等仿生学设备对其感官品质进行检测。结果显示,发酵乳杆菌纯种发酵的酸浆水鲜味明显高于加引子发酵,而酸味和涩味呈现相反的趋势;挥发性风味方面,乳酸菌纯种发酵的酸浆水中芳香类物质的强度显著高于加引子发酵（P<0.05）;经色度仪检测发现,乳酸菌纯种发酵酸浆水明亮度及绿度较引子发酵酸浆水高,二者色差显著（P<0.05）。多元统计学分析结果显示不同发酵方式制作的酸浆水品质整体存在显著性差异,导致差异的主要指标为鲜味、芳香类以及烷烃类挥发性风味物质。综上,乳酸菌纯种发酵的酸浆水品质更优。     

襄阳地区高温大曲和中高温大曲真菌多样性解析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对采集自湖北省襄阳市某酒厂的高温大曲和中高温大曲的真菌群落结构进行解析。结果表明,高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（57.43%）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）（30.73%）为主,而中高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（48.05%）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）（17.72%）和曲霉菌属（Aspergillus）（14.56%）为主。虽然两类大曲共有核心操作分类单元（OUT）包含的序列数占总序列数的64.21%,但经主坐标分析（PCoA）和聚类分析（CA）发现两类大曲在空间排布上呈现明显分离趋势。经线性判别分析效应量（LEfSe）分析发现,导致两类大曲真菌群落结构存在差异的菌属为嗜热真菌属（Thermomyces）。一些真菌类群在高温大曲和中高温大曲中均存在,但两类大曲亦具有各自较为独特的真菌类群。     

基于MiSeq高通量测序技术渣豆酱微生物类群研究

该研究采用MiSeq高通量测序技术对鹤峰地区渣豆酱中细菌和真菌多样性进行了解析。结果发现,硬壁菌门（Firmicutes）为优势细菌门,芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）为优势细菌属,平均相对含量分别为92.0%、56.87%和24.28%;子囊菌门（Ascomycota）为优势真菌门,青霉属（Penicillium）、耐碱酵母属（Galactomyces）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）为优势真菌属,平均相对含量分别为82.57%、19.42%、17.09%和16.12%;经Mood-median检验发现,细菌的丰度显著低于真菌（P＜0.05）,而多样性差异不显著（P＞0.05）;经相关性分析发现,芽孢杆菌属与德巴利酵母属呈显著负相关（R=-0.997,P＜0.05）,乳酸杆菌属与念珠菌等真菌属均呈显著正相关（P＜0.05）,且相关系数均大于0.999。由此可见,鹤峰地区渣豆酱中细菌主要为芽孢杆菌属和葡萄球菌属,真菌主要为青霉属、耐碱酵母属和接合酵母属。