肝再生增强因子联合肝细胞脾内移植治疗急性肝衰的实验研究

目的:探讨应用rALR与新生大鼠肝细胞脾内移植联合治疗大鼠急性肝衰竭的疗效.方法:采用D-gal诱导大鼠急性肝衰竭模型,36h后随机分为6组:(Ⅰ组:造模对照组;Ⅱ组:脾脏注射生理盐水1ml,腹腔注射生理盐水1ml/d;Ⅲ组:脾脏注射rALR 1ml(50μg/(kg·d)),腹腔注射rALR 1ml(50μg/(kg·d));Ⅳ:脾脏移植2×107新生大鼠肝细胞,腹腔注射生理盐水1ml/d;Ⅴ组:脾脏移植2×107新生大鼠肝细胞,腹腔注射rALR 1ml;Ⅵ组:脾脏移植2×107新生大鼠肝细胞,腹腔注射CsA1ml(10mg/(kg·d)).比较各组生存率.术后第1、5天、14天获取肝组织,观察病理变化.术后第1、2、5、12天采血,检测肝功能指标.结果:Ⅱ组存活时间与Ⅰ组比较无差异.Ⅲ组最长存活时间为118h,肝脏病理及肝功能改变情况基本同Ⅰ组和Ⅱ组.Ⅳ组有部分长期存活,2周生存率为33.3%.Ⅴ组两周存活率显著高于Ⅳ组(75%对33.3%,P＜0.02),Ⅵ组和Ⅳ组2周存活率比较无显著性差异(P＞0.05).肝功能及病理情况在Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组有明显改善,尤以Ⅴ组最为显著.)结论:应用rALR联合新生大鼠肝细胞移植能有效治疗大鼠急性肝衰竭,改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,促进肝功能恢复及改善肝脏病理状况.     

肝细胞脾内移植治疗大鼠肝衰竭

目的:优化急性肝衰竭模型的构建方法及探讨经脾内同种异体肝细胞移植治疗大鼠急性药物性肝衰竭的疗效,并观察脾内移植肝细胞的生物学活性。方法:采用D-氨基半乳糖(D-gal)建立大鼠急性药物性肝衰竭模型。腹腔注射不同剂量的(1.0,1.2,1.4,1.6g/kg)D-gal后,以肝功能指标、病理形态学、死亡率等综合评估肝脏细胞损伤的状态,确定模型构建的最佳方案。造模后24h,随机分为2组进行治疗,Ⅰ组:经脾内移植肝细胞悬液1ml(4.4×107个);Ⅱ组:经脾内移植不含肝细胞的培养液1ml。观察大鼠1周的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学活性。结果:①不同剂量的D-gal可导致不同程度的肝损伤,而以1.2g/kgD-gal造模组的大鼠死亡率适中,肝功能损害及其肝脏病理组织学改变均符合临界急性肝衰竭的程度,较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。②移植后3d,Ⅰ组与Ⅱ组大鼠存活率相比具有显著性差异(P<0.01);肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBiL)均有明显改善(P<0.01);肝组织病理切片显示:Ⅰ组的肝组织损伤程度明显比Ⅱ组轻。经HE和PAS染色证实,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。结论:①D-gal1.2g/kg腹腔注射可较好构建SD大鼠急性肝衰竭模型。②经脾内肝细胞移植能明显提高药物性肝衰竭大鼠的存活率、改善肝功能及肝组织病理变化。     

PLA-O-CMC纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生作用的初步研究

目的:探讨胶原凝胶包埋聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子粘附培养猪肝细胞移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠肝的再生作用。方法:D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型;48h后分别将5mlⅠ型胶原凝胶包埋的PLA-O-CMC纳米粒子粘附培养24h猪的肝细胞、5mlⅠ型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞、5ml培养24h的猪肝细胞悬液(均含5.0×107个)移植到各组ALF大鼠腹腔内,并以5mlRPMI1640腹腔内注射作为阴性对照。观察大鼠14天存活率和受体肝脏的病理变化。结果:移植后14天ALF大鼠的存活率:单纯肝细胞移植组(Ⅰ组)为56.25%,胶原肝细胞移植组(Ⅱ组)为62.5%,纳米胶原肝细胞移植组(Ⅲ组)为75%,阴性对照组(Ⅳ组)为18.75%,各移植组14天存活率高于对照组(P<0.05),各移植组间无统计学意义(P>0.05)。ALF大鼠肝脏再生于ALF后5～7天最为显著;各组肝脏病理变化以Ⅲ组恢复最好,双核细胞最多,肝再生最快。结论:应用PLA-O-CMC纳米粒子和Ⅰ型胶原联合培养猪肝细胞移植于ALF大鼠腹腔内能促进肝脏的再生。     

肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的研究

目的 :探讨同种异体肝细胞经腹腔、脾腔移植对 D-氨基半乳糖 ( D- gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用。方法 :采用 D- gal诱导大鼠急性肝衰竭 ,诱导后 6 0小时 ,分 4组进行治疗实验 ,I组 :脾内移植 2× 10 7肝细胞 ,同时肌肉注射环孢霉素 A ( Cs A ) 10 m g/kg;II组 :脾内注射生理盐水 1m l,同时肌注 Cs A 10 m g/kg;III组 :经腹腔移植 2× 10 7肝细胞 ,IV组 :经腹腔注射生理盐水1m l,观察大鼠的存活率、肝脏功能、肝脏病理变化情况。结果 :I组大鼠存活率与 II组有明显差异( 46 .7%对 13.3% P<0 .0 5) ,肝脏功能及肝脏病理亦有改善 ,III组大鼠存活率显著高于 IV组( 6 0 %对 13.3% P<0 .0 1) ,肝脏功能及肝脏病理均有部分改善。结果 :经腹腔、脾脏移植同种异体肝细胞可明显改善 D- gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率 ,部分改善肝功能及肝脏病理     

肝细胞移植联合肝再生增强因子治疗大鼠急性肝功能衰竭的研究

目的 探讨同种异体肝细胞腹腔移植联合肝再生增强因子(augmenter of liver regenration, ALR)对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝功能衰竭大鼠的治疗作用.方法 采用D-gal诱导大鼠急性肝功能衰竭,诱导后24 h,59只大鼠随机数字表法分成4组.Ⅰ组15只:腹腔注射生理盐水;Ⅱ组15只:经腹腔移植2×107肝细胞, 以后腹腔注射生理盐水;Ⅲ组15只:经腹腔移植2×107肝细胞,同时腹腔注射ALR 50 μg·kg-1·d-1;Ⅳ组14只:腹腔注射ALR50 μg·kg-1·d-1.观察大鼠的存活率、肝脏功能、移植肝细胞存活情况、病理变化.结果 Ⅱ组、Ⅲ组大鼠存活率(46.7%、66.7%)显著高于Ⅰ组(0.0%)(P=0.006;P=0.0002),Ⅲ组(66.7%)与Ⅳ组(14.3%)有显著差异(P=0.008),其他组间无明显差异(P＞0.05).移植后第1、2天Ⅱ组腹水AST高于Ⅲ组(P=0.001), Ⅱ组第1、2天腹水ALT高于Ⅳ组,Ⅱ组、Ⅲ组第1、2天腹水TBil高于Ⅰ组(P＜0.05).Ⅲ组肝脏病理改变轻于其他组.Ⅲ组大鼠腹腔移植的肝细胞存活数多于Ⅱ组.结论 同种异体肝细胞经腹腔移植联合ALR可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,促进移植肝细胞存活和增殖,促进肝组织及功能恢复.     

混合细胞共微囊化对肝细胞功能的支持作用

目的观察大鼠肝细胞、转基因肝星状细胞株HGF／CFSC和／或大鼠骨髓来源Thy-1^＋β2M^-细胞（BDTC）共微囊化对肝细胞生物学活性的支持,及腹腔移植混合细胞微囊对急性肝衰竭大鼠肝功能的改善作用。方法利用微囊发生器制备含肝细胞或混合细胞的微囊,依微囊内包裹细胞种类不同,分为微囊化肝细胞组、微囊化肝细胞＋CFSC／HGF组）和微囊化肝细胞＋CFSC／HGF＋BDTC组,通过观察囊内细胞形态和体外培养测定培养液中白蛋白和尿素的分泌,判断各组囊内肝细胞活性和功能的维持;将90％肝大部切除所致的急性肝衰竭大鼠按照移植微囊种类不同分为空囊对照组和上述3个实验组（每组10只）,观察腹腔植入后不同时间大鼠的一般状况、存活时间、血生化改变、肝组织再生及微囊化移植物的组织学特征。结果与单独肝细胞微囊者相比,混合细胞微囊内肝细胞存活时间超过1倍,培养液中白蛋白分泌和尿素合成量明显增加（均P〈0．01）;与对照组相比,微囊化肝细胞或微囊化混合肝细胞移植后,急性肝衰竭大鼠的肝功能显著改善、存活率明显提高（10／10 vs 1／10）,其肝组织再生完全;移植21—42d时,部分微囊附着于肝脏表面并出现血管化,微囊表面存在不同程度的纤维化,微囊内仍有存活的细胞,以微囊化混合肝细胞组优于微囊化肝细胞组。结论混合细胞共微囊化能明显改善囊内肝细胞的存活寿命、形态和功能的维持,微囊化混合肝细胞腹腔移植对促进急性肝衰竭大鼠的肝功能恢复具有显著作用。     

微囊化异种肝细胞移植对药物性肝衰的治疗作用及免疫隔离机制的初步研究

目的 :探讨微囊化异种肝细胞脾内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用 ;测定受体存活率、肝功能的变化及CD4 ,CD8的变化。方法 :海藻酸钠体外包裹经胶原酶技术制备的异种 (豚鼠 )肝细胞为供体 ,SD大鼠为受体 ,D -氨基半乳糖 (19.5ml/kg)腹腔内一次性注射 ,制作肝衰模型。 4 8h后将微囊化的游离豚鼠肝细胞 (1.5× 10 7)移植于大鼠脾脏内。以豚鼠裸肝细胞 (1.5× 10 7)移植及生理盐水1.2ml脾脏注射为对照。移植后 14d观察存活率、肝功能及肝脏病理情况 ,免疫组化ABC法测定CD4 ,CD8的变化。结果 :微囊化肝细胞移植组存活率 80 % ,明显高于生理盐水组 (2 5 % )和裸肝细胞移植组(70 % )。 (P <0 .0 1　V　P <0 .0 5 )。微囊肝细胞移植组 14d总胆红素 (7.99± 0 .5 8mg/L)和ALT(5 5±6 .7u) ,明显低于生理盐水组 (9.6 3± 0 .83mg/LV 91± 8.0u)和裸肝细胞组 (8.9± 0 .6 6mg/LV 74± 7.1u)(P <0 .0 5VP <0 .0 1)。移植后 12h ,72h ,14d分别测定受体脾脏CD4 ,CD8淋巴细胞 ,微囊化肝细胞组72h ,14d呈阳性。裸肝细胞组均呈阳性。结论 :大鼠药物性肝衰微囊化肝细胞脾内移植后维持存活率14d ,细胞免疫参与排斥反应 ,肝细胞微囊化处理可延迟细胞免疫的发生时间。     

解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠Caspase-8、BID的影响

目的解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠Caspase-8、Bid的影响。方法将急性肝衰动物模型随机分成模型组、裸肝细胞移植组、微囊化肝细胞移植组、解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组。造模后24 h、48 h、72 h、120 h和168 h测定ALT、AST,免疫组化法检测Caspase-8、Bid表达。结果解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组ALT、AST下降,48 h、72 h与裸肝组、微囊组比较差异有统计学意义(P<0.05);解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组Caspase-8、Bid表达下降,48～168 h较裸肝组、微囊组有统计学意义(P<0.05)。结论解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植显著改善肝衰大鼠肝功能及预后。     

永生化肝细胞移植治疗肝衰竭

目的: 观察永生化胎肝细胞及胚胎肝细胞经脾脏移植对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法: 采用D-gal诱导大鼠急性肝衰竭,分3组进行治疗实验,Ⅰ组: 经脾脏移植永生化胎肝细胞2×107个;Ⅱ组: 移植原代胚胎肝细胞2×107个;Ⅲ组: 脾脏注射生理盐水1 mL,各组大鼠同时肌肉注射环孢霉素A(CsA) 10 mg/kg. 观察大鼠的存活率、肝脏功能、肝脏病理变化情况. 结果: Ⅰ组及Ⅱ组大鼠存活率均显著高于Ⅲ组大鼠(72.2% vs 22.2%, 61.1% vs 22.2%, P＜0.01),肝脏功能及肝脏病理均有改善, Ⅰ组与Ⅱ组之间大鼠存活率无明显差异(72.2% vs 61.1%, P＞0.05). 结论: 经脾脏移植胚胎肝细胞可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,改善肝功能及肝脏病理,该永生化胎肝细胞可以成为肝细胞移植研究中的理想细胞材料.     

肝细胞移植对大鼠实验性肝衰竭的疗效研究

目的　探讨同种异体肝细胞经腹腔、门静脉移植对D-氨基半乳糖 (D- gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用 .方法　采用 D- gal诱导大鼠急性肝衰竭 ,诱导后 6 0 h,分 4组进行治疗实验 , 组 :经门静脉移植 2× 10 7肝细胞 ,同时肌注环孢霉素 A(Cs A) 10 mg· kg- 1 ; 组 :经门静脉注射生理盐水 1m L ,同时肌注 Cs A 10 mg· kg- 1 ; 组 :经腹腔移植 4×10 7肝细胞 ; 组 :经腹腔注射生理盐水 2 m L ,观察大鼠的存活率、肝脏功能、病理变化 .结果　 组大鼠存活率与 组无明显差异 (42 % vs 37% ,P>0 .0 5 ) ,肝脏功能、病理无明显改善 . 组大鼠存活率显著高于 组 (75 % vs 33% ,P<0 .0 5 ) ,肝脏功能、病理均有部分改善 .结论　经腹腔移植同种异体肝细胞可明显改善 D- gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率 ,部分改善肝功能、病理 ;经门静脉移植同种异体肝细胞不能改善D- gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率、肝脏功能及病理改变 .     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

一种小鼠原代肝细胞培养方法

目的寻求一种简易、廉价的原代小鼠肝细胞培养方法。方法采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液，以低血清进行肝细胞单层培养。结果通过多次探索、观察，比较成功地进行了原代肝细胞培养。结论此方法适合一般实验室开展肝细胞培养。     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

移植胎肝细胞在体内分布和存活的示踪观察

我们观察了胎肝细胞的在体同位素标记及其影响因素;同时应用同位索标记的胎肝细胞,观察了胎肝细胞移植后在受体体内的分布格局和存活情况及其一些影响因素。实验发现,经胎鼠腹腔注射,~(125)I-UdR时,胎肝摄取~(125)I-UdR最多。标记胎肝细胞经外周静脉注射给成年小鼠后,主要分布在肺和肝中,这种分布格局受注射胎肝细胞数量和速度的影响。结果提示:在体法同位素标记的胎肝可用于胎肝细胞移植研究。     

梗阻性黄疸肝脏超微结构改变及其损伤机制

目的:通过观察梗阻性黄疸肝脏超微结构改变进一步探讨其损伤机制。方法:Wistar大鼠72只随机分为胆总管结扎组、假手术组和正常对照组,每组24只,胆总 管结扎组大鼠制成梗阻性黄疸动物模型,利用透射电子显微镜和7150型全自动生化分析仪观察各组大鼠肝组织超微结构及其功能改变。结果:实验组肝细胞核形态异常、固缩,线粒体脊断裂,内质网减少且肿胀,毛细胆管扩张,内有胆泥淤积。生化检测肝功能胆红素、血胆汁酸、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶与假手术组和对照组比较差异有显著性（P<0.01）。结论:梗阻性黄疸肝脏损伤可能与内毒素、胆汁酸血症、肝细胞缺血和Kupffer细胞功能受损有关。     

右旋儿茶素对四氯化碳或半乳糖胺引起原代培养大鼠肝细胞毒性的作用

利用原代培养大鼠肝细胞的方法,研究右旋儿茶素(d-CTC)对四氯化碳(CCl_4)或半乳糖胺(d-GalN)引起肝细胞毒性的作用,并观察该药对肝酶的直接作用。结果表明:d-CTC 0.6～5.0mg/ml可使含10mmol/L CCl_4或5mmol/Ld-GalN肝细胞培养液中的GOT.GPT及LDH活性显著降低,并呈量效关系。d-CTC 2.5～5.0mg/ml可直接抑制LDH及GPT活性,但对GOT无明显影响。其抑酶作用与抗肝毒而降低酶活性比较,有非常显著的差别,提示d-CTC具有较强的抗肝毒作用。     

永生化人胎肝细胞系LC-1的建立

目的 建立人源性永生化肝细胞.方法 利用含有SV40T和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox,转染包装细胞PT67;取病毒上清液感染原代培养的人胎肝细胞,用G418筛选成功转导的永生化细胞系;用细胞计数法测定永生化细胞增殖特性,免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白表达,放免法和自动生化仪检测清蛋白和尿素氮合成功能.结果 获得的一个细胞系命名为LC-1,其细胞群体倍增时间约为17h,可表达清蛋白、CK18肝细胞特征和CK19等胆管特征蛋白,具有清蛋白与尿素氮合成功能.结论 成功建立了具有良好的增殖能力、分化状态、肝细胞生物学特征的永生化肝细胞系.     

28℃条件下短期培养新生广西巴马小型猪肝细胞的初步观察

目的对28℃条件下短期培养猪肝细胞的可行性进行初步评价.方法将刚分离的新生广西巴马小型猪肝细胞采用28℃条件下的短期培养1～3 d后,恢复37℃继续培养,观察升温前后肝细胞的形态及LDH、AST的释放量,检测28℃短期培养后肝细胞的氨清除率和尿素合成量.结果在28℃短期培养的肝细胞,用倒置相差显微镜观察到典型的形态特征,细胞未见明显增殖,恢复37℃继续培养后,肝细胞迅速增殖并维持典型的肝细胞形态;经28℃短期培养后的肝细胞和未经28℃短期培养的肝细胞均保持较强的尿素合成和氨清除能力,但在28℃培养2 d和3 d后的肝细胞尿素合成量较在28℃培养1 d后的肝细胞尿素合成量显著降低(P＜0.01);培养期内LDH、AST漏出量较少.结论28℃短期培养能较好地维持猪肝细胞的形态学特征和功能,有望成为一种有效的保存和运输生物人工肝细胞材料的方法.     

体外培养树鼠句肝细胞的初步观察

目的 探讨体外培养的树Qu肝细胞形态结构与生物合成功能。方法 采用体外两步灌流法分离肝细胞,以L15培养基予以培养,光电镜下动态观察细胞形态结构,同时检测不同时相点培养上清中蛋白及甲胎蛋白含量。结果 采用简易体外两步灌流法分离的肝细胞,经台盼蓝拒染试验证实肝细胞的存活率为90％,体外培养的肝细胞在第3－10天具有良好的增殖分化功能,维持此形态和功能至培养第18天。结论 体外培养的树Qu肝细胞具有良好的形态结构和生物合成能力,能够满足肝炎病毒体外研究培养的需要。     

猪肝细胞的分离与原代培养

目的：建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果：平均每只猪可获得2×10¹⁰个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论：原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏（HBLSS）应用中细胞来源问题的主要途径。