发酵菌株HGPA20的蛋白酶活性及形态学研究

传统的家庭自制豆酱是利用空气中的微生物自然发酵而成,这个过程酱醅表面附着了大量的真菌,某些功能菌株产生胞外蛋白分解大豆蛋白,使其变成人体能直接吸收利用的小肽。研究从东三省各地采集家庭自制豆酱,对豆酱上的真菌进行分离、培养及纯化。通过酪蛋白平板初筛获得具有蛋白酶活性的菌株35株。通过发酵复筛提取其粗酶液,用福林酚法测定蛋白酶活性,筛选出1株具有较高蛋白酶活性的曲霉菌HGPA20,经标准培养、形态学鉴定,确定该菌为米曲霉。     

传统发酵豆酱中产脂肪酶菌株的筛选

脂肪酶属于羧基酯水解酶类,能将甘油三酯逐步地水解成甘油和脂肪酸。该研究从东北三省传统的家庭自制豆酱上获得纯培养真菌389株,通过三丁酸甘油酯平板法初筛获得具有脂肪酶活性的菌株41株,其中青霉属的真菌27株、曲霉5株、毛霉3株、犁头霉2株、酵母菌1株、镰孢菌2株、帚霉菌1株。结果表明,青霉属的真菌无论从数量还是酶活都高于其他属的真菌,其中橘灰青霉（Penicillium aurantiogriseum）数量最多。在分离到的菌株中,毛霉属的卷枝毛霉（Mucor circinelloides）酶活最高,是具有生物催化潜力的功能菌株。     

传统发酵豆酱中产α-淀粉酶菌株的筛选

α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中,能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等,是食品工业中应用最为广泛的酶制剂之一。从东北三省传统的家庭自制豆酱上获得纯培养真菌389株,通过可溶性淀粉平板初筛获得具有α-淀粉酶活性的菌株34株,其中曲霉属的真菌14株、青霉12株、毛霉2株、镰孢菌2株、帚霉1株、犁头霉1株、木霉2株。米曲霉(Aspergillus oryzae)、橘灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)和疣状青霉(Penicillium verrucosum)出现频率较高,是豆酱发酵过程中产生α-淀粉酶的优势种群。     

一株适用于生产饲用复合酶制荔菌株的生物学特征性及酶系分析

乾氏曲霉又名流球曲霉，是属于黑曲霉群中具有重要应用前景的菌株。而黑曲茵霉6号是本实验室工作人员诱变乾氏曲霉得到的一株纤维酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活较高的菌株。本实验室对黑曲霉6号的一般生物学特性及培养特征进行了研究，并对其主要酶系一纤维素酶、蛋白酶、淀粉糖化酶和果胶酶进行了酶系分析、活生测定和最佳产酶条件的分析，为应用试验打下基础。     

湖光岩水体与泥层中真菌的分离鉴定及抗菌活性研究

从湖光岩的湖水、泥土中分离出30株真菌,根据形态特征确定其种属,通过管碟法测定其抗菌活性。结果表明青霉属15株、曲霉属4株、酵母属4株、木霉属2株、毛霉属1株、粘帚霉属1株、根霉属1株。具有抗菌活性的菌株11株:9株具有抗金黄色葡萄球菌活性;1株具抗金黄色葡萄球菌活性及抗枯草芽孢杆菌活性;1株有抗大肠埃希氏菌活性、抗金黄色葡萄球菌活性及抗枯草芽孢杆菌活性。     

山东省部分地区2018年收获玉米的真菌污染状况研究

目的 对山东省部分地区2018年产玉米表面污染真菌进行调查。方法 在马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar, PDA)上通过稀释涂布的传统分离培养方法获得真菌菌株, 利用传统的形态学与分子生物学技术相结合的方法对真菌种类鉴定。结果 共获得真菌菌株169株, 经形态学鉴定隶属于8属: 镰刀菌属(Fusarium), 青霉属(Penicillum), 曲霉属(Aspergillus), 交链孢属(Alternaria), 枝顶孢属(Acremonium), 梗霉属(Lichtheimia), 枝孢属(Cladosporium)、篮状菌属(Talaromyces)。其中, 镰刀菌(Fusarium)、青霉(Penicillum)、曲霉(Aspergillus)分离获得的数量最多, 镰刀菌种类是引起玉米穗腐病的主要病原菌, 其污染主要来自于田间。随玉米仓储时间延长, 优势真菌改变为青霉属和曲霉属。结论 山东地区玉米真菌污染初期以田间污染为主, 储藏过程中优势菌群受环境影响发生改变; 需要根据真菌污染状况改进提升传统果穗囤藏技术。     

黑曲霉Ⅵ号主要水解酶类的酶系分析及最佳产酶条件的研究

乾氏曲霉又名琉球曲霉，是属于黑曲霉群中具有重要应用的菌株。而黑曲霉６号是本实验室工作人员诱变氏曲霉得到的一株纤维素酶，蛋白酶等酶活较高的菌株。本实验对黑曲霉６号的一般生物学特性及培养特性进行了研究，并对其主要酶系－纤维素酶、蛋白酶、淀粉糖化酶和果胶酶进行了酶系分析，活性测定，最佳产酶条件的分析及应用实验。     

普洱茶中真菌合成洛伐他汀的能力分析

对从普洱茶中分离的曲霉、青霉和木霉属真菌进行纯培养,采用液相色谱法分析培养基中洛伐他汀的含量,鉴定普洱茶中真菌合成洛伐他汀的能力。结果显示：曲霉属真菌中1株塔宾曲霉、1株温特曲霉和1株烟曲霉具有合成洛伐他汀的能力,在察氏(CYA)培养基中检测到的洛伐他汀含量分别为(9.59±0.42)、(2.33±0.21)、(2.77±0.13)ng/g;青霉属真菌中只有产黄青霉在CYA培养基上能检测到洛伐他汀的存在,检测含量为(3.36±0.69)ng/g;而从普洱茶中分离到的2株木霉属真菌--棘孢木霉和橘绿木霉均具有合成洛伐他汀的能力,在CYA培养基中检测到的洛伐他汀的含量分别为(4.8±0.17)、(1.47±0.36)ng/g。     

发酵菌株GQ3-2的酶活及形态学研究

豆酱是中国传统的发酵食品,在天然发酵过程中其表面附着了大量真菌类群。有些种类具有α-淀粉酶活性,能水解淀粉产生葡萄糖、糊精、麦芽糖和低聚糖等;有的则产生蛋白酶,分解大豆蛋白为可被人体吸收、利用的小肽。从东三省254份家庭自制豆酱中分离发酵功能菌株,利用可溶性淀粉平板获得具有α-淀粉酶活性的菌株34株,利用酪蛋白平板获得具有蛋白酶活性的菌株35株。其中菌株GQ3-2同时具有很高的淀粉酶和蛋白酶活性,经标准培养、形态学鉴定,确定菌株GQ3-2为赭曲霉。     

黑曲霉6号主要水解酶类的酶系分析及最佳产酶条件的研究

乾钉曲霉又名琉球曲霉,是属于黑曲霉群中具有重要应用前景的菌株。而黑曲霉６号是本实验室工作人员诱变乾氏曲霉得到的一株纤维素酶、蛋白酶等酶活较高的菌株。本实验对黑曲霉６号的一般生物学特性及培养特性进行了摸索,并对其主要酶系－纤维素酶、蛋白酶、淀粉糖化酶和果胶酶进行了系分析、活性测定、最佳产酶条件的分析,为应用试验打下基础。     

脱苦蛋白酶霉菌菌株的选育

从自然发酵的豆酱中分离得N3株蛋白酶高产菌株M1、M2、M3和供试的安全菌株毛霉、黑曲霉、栖土曲霉在各自的固、液体发酵培养基中培养，从中筛选出蛋白酶活力最高且蛋白酶液能脱除苦味肽苦味的菌株M3。根据M3菌株的菌落形态和菌体形态确定属于曲霉属。     

年糕中微生物的分离纯化和鉴定

通过对发生腐败变质的真空包装年糕中微生物进行分离、纯化和反证得到2株细菌、3株酵母菌、1株霉菌。经过形态观察、生理生化、微生物鉴定系统等方法,初步鉴定2株细菌分属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.),3株酵母菌都属于假丝酵母属(Candida spp.),1株霉菌属于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。     

海洋真菌产酶能力的研究

从大连丽娇湾和金石滩采集获得海水、海藻等样品,采用PDA培养基分离海洋真菌,并对产酶真菌进行筛选及鉴定,及其产酶能力进行初步研究。结果显示,共筛选得到真菌32株,产酶菌株18株,其中有1株同时产4种酶,3株同时产3种酶,8株同时产2种酶。初步鉴定18株产酶菌分布于4个属,其中优势属为曲霉属（Aspergillus sp.）和青霉属（Penicillium sp.）,各6株,均占总筛选产酶菌株数的33.33%,其次为酵母属（Saccharomyces sp.）,共4株,占总筛选产酶菌株数的22.22%。11株产植酸酶、10株产纤维素酶、6株产淀粉酶、5株产蛋白酶、3株产脂肪酶。     

白鱼腐败细菌的分离与鉴定

通过对不同温度条件下白鱼（Anabarilius）菌落数量的统计发现, 与37 ℃相比,25 ℃培养条件更有利于白鱼携带细菌的生长,也更容易导致白鱼的腐败。通过对分离自腐败的白鱼中21 株细菌的16S rDNA序列分析后,最终确定得到了11 株不同的菌株。同时结合生化鉴定结果,将这些菌种分属7 个不同的属：2 株摩根氏菌（Morganella）,3 株变形杆菌（Proteus）,2 株漫游球菌（Vagococcus）,1 株葡萄球菌（Staphylococcu）,1 株泰瑞芽孢杆菌（Terribacillus）,1 株赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus）,1 株透明颤菌（Vitreoscilla）。其中摩根氏菌和变形杆菌同属肠杆菌科,是腐败白鱼的优势菌,可能是白鱼的特定腐败菌 （specific spoilage organisms,SSO）。     

菌种接种方式对黄豆酱品质的影响

以沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、沪酿3.130毛霉、AS 3.972红曲霉、米根霉和枯草芽孢杆菌为菌种进行制曲、发酵,通过测定发酵7 d后蛋白酶活力和氨基酸态氮含量,研究单菌种制曲发酵、曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵方式对黄豆酱品质的影响。结果表明:曲料混合发酵产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量效果最好,其次为多菌种混合制曲发酵和单菌种制曲发酵。曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵中,2菌种和3菌种组合产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量整体较高,其中曲料混合发酵5号(沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢杆菌)产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量最佳,分别达到713 U/mL和0.89 g/100 g。研究发现,沪酿3.042米曲霉成曲、AS 3.35黑曲霉成曲和枯草芽孢杆菌成曲按照曲料混合发酵方式接种更有利于得到品质较优黄豆酱。     

白曲酸性蛋白酶在无孢黑曲SH-2中的克隆表达及酶学性质分析

白曲霉酸性蛋白酶在白酒酿造发酵过程中具有溶解发酵原料的颗粒,促进微生物繁殖,分解蛋白质生成香味物质,降解酵母菌体蛋白等多种功能,可以提高白酒风味,因此被广泛应用于白酒生产中。本研究利用经基因工程改造的低内源蛋白背景的黑曲霉宿主SH-2,表达白曲霉酸性蛋白酶基因pepB。通过PCR技术获得pepB以及表达元件糖化酶启动子PglaA、糖化酶终止子TglaA、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶标记基因pyrG,在pMD18-T载体基础上,构建了pepB表达载体,通过PEG介导转化法转化无孢黑曲酶SH-2。重组菌株经发酵罐发酵240 h,发酵粗酶液酶活达9722 U/mL,是报道的白曲原始菌株酶活的8.5倍,SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为47 ku。酶学性质分析结果表明,该酸性蛋白酶最适反应温度为35℃,最适pH为4.0,Mn~(2+)、Cu~(2+)对酶活有显著地激活作用。最后,探究了在不同发酵初始pH下重组菌株酶活的变化,结果显示,在pH 4.5~6.5范围内,适当提高发酵初始pH,酸性蛋白酶酶活会提高。以上结果表明,本研究成功构建了一株能胞内高效表达白曲酸性蛋白酶的菌株。     

浏阳豆豉发酵中高产酶活菌株的分离鉴定及酶活性分析

从浏阳豆豉发酵过程中分离产高酶活菌株,通过形态观察结合分子生物学技术进行鉴定,并对其产蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶的活性进行分析。结果表明,分离得到3株菌（编号为000、5132、621）均被鉴定为溜曲霉菌（Aspergillus tamarri）。3株菌的蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶的活性测定结果表明,菌株621蛋白酶活性最强,为（207.98±3.20）U/mL;菌株5132的纤维素酶活性最强,为（3.40±1.40）U/mL;菌株000的脂肪酶活性最高,为（90.7±0.64）U/mL。     

华莱士瓜采后丝状真菌的分离及rDNA ITS区序列分析

从采后贮藏期间自然发病的华莱士瓜上分离到12 株丝状真菌,将分离菌经纯化后回接到健康无损的华莱士瓜上,发病特征与分离发病果实一致,确定其为华莱士瓜的病原菌。结合形态学观察和rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列分析,结果表明：分离到1 株黑附球菌（Epicoccum nigrum）、1?株草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）、2 株链格孢属（Alternaria Nees ex Wallr.）真菌、3 株曲霉属（Aspergillus Micheli ex Fr.）真菌和5 株镰刀属（Fusarium LK. ex Fr.）真菌。其中,黑附球菌（E. nigrum）为甜瓜中首次发现的病原菌,而草酸青霉菌（P. oxalicum）、细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）、泡盛曲霉菌（Aspergillus awamori）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、轮状镰刀菌（F. verticillioides）和燕麦镰刀菌（F. avenaceum）分别为甜瓜上分离到的青霉属、链格孢属、曲霉属和镰刀属的新菌株。     

五株有机高分子化合物降解菌的生物安全性分析

以分离自环洞庭湖水系的3个淡水湖渔场表层底泥样品中的2株产几丁质酶菌株及3株产胶原蛋白酶菌株为研究对象,对其进行酶活分析及分子生物学鉴定,并通过药敏性、溶血性、氨基酸脱羧酶活性及硝酸还原酶活性实验对其安全性进行评价。结果表明,2株产几丁质酶菌株AL1、BM1分别被鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）;3株产胶原蛋白酶菌株ALJ1、BMJ1及DJ2分别被鉴定为Pseudomonas sp.、Pseudomonas sp.和微小杆菌（Exiguobacterium sp.）。安全性试验结果表明,菌株DJ2、BMJ1分别对6种和4种抗生素高度敏感,其余菌株仅对1种抗生素高度敏感;除菌株AL1外,其余4株菌均无溶血性;除菌株DJ2外,其余4株菌均有氨基酸脱羧酶活性;5株菌均无硝酸还原酶活性。综上,菌株BM1和DJ2是降解有机高分子化合物的较安全菌株,可将其应用于有机高分子化合物的降解。