以患者为中心的药物研发策略

介绍美国食品及药物管理局（FDA）以患者为中心的药物开发思路,展示了不同疾病、治疗收益、使用环境分别对应的临床结局评估（COA）工具,整理出5个已获批患者报告结局（PRO）工具的相关信息,并归纳了2010—2015年FDA获批新药中,应用PRO评估工具支持说明书相关声明的药品信息。旨在为业界选择适合的COA类型（PRO、ClinRO、ObsRO或PerfO评估工具）应用于药物研发提供借鉴,并建议将COA工具用于儿科、罕见病、认知障碍相关疾病以及中药的临床疗效评估;同时也为将患者的观点纳入药品监管流程提供参考。     

大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的体内外遗传毒性评价

目的:评价大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(EG)的体内外遗传毒性,并比较体外细胞试验及大鼠体内实验评价结果的差异。方法:采用体外二维(2D)、三维(3D)细胞培养法分别构建2D、3D HepaRG细胞模型,造模成功后,分别将2D、3D HepaRG细胞分为空白对照组[0.5%二甲基亚砜(DMSO)]、丝裂霉素C组(阳性对照,0.1μg/mL)和EG低、中、高剂量组(10、50、200μg/mL),然后检测各组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量。将SD大鼠分为空白对照组(0.5%羧甲基纤维素钠)、甲磺酸乙酯组(阳性对照,200 mg/kg)和EG低、中、高剂量组(100、300、1 000 mg/kg),每组6只,连续灌胃给药15 d,每天1次;15 d后检测各组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率及外周血淋巴细胞、肝细胞的尾DNA百分含量、尾距。结果:在体外2D HepaRG细胞模型中,与空白对照组比较,丝裂霉素C组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量均显著升高(P<0.01),EG各剂量组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量差异无统计学意义(P>0.05);在3D HepaRG细胞模型中,与空白对照组比较,丝裂霉素C组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量均显著升高(P<0.01或P<0.001),EG高剂量组HepaRG细胞的尾DNA百分含量显著升高(P<0.01)。在大鼠体内实验中,与空白对照组比较,甲磺酸乙酯组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率和外周血淋巴细胞、肝细胞的尾DNA百分含量、尾距均显著升高(P<0.01),EG高剂量组大鼠外周血淋巴细胞尾DNA百分含量显著升高(P<0.01),EG各剂量组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率和肝细胞尾DNA百分含量、尾距差异无统计学意义(P>0.05),但随剂量增加有升高趋势。结论:本研究结果提示在2D细胞模型中,EG未导致染色体断裂及DNA损伤,但3D细胞模型长期给药和体内重复给药结果均显示EG存在一定DNA损伤风险,故3D HepaRG细胞模型的评价结果更接近大鼠体内实验结果。     

哺乳动物细胞染色体畸变试验的标准化与背景数据采集

染色体畸变试验作为保健食品、化妆品、药品、医疗器械上市前常规开展的毒理学试验项目,是检测化学物质对染色体数量和结构影响的基本方法。确立标准化试验方法并积累一定的背景数据,是试验系统和数据真实可靠性的有力保障,可为科研人员和审评专家的数据分析提供有力依据。首先就影响染色体畸变试验结果的因素进行简要综述,继而通过回顾国内外2012-2017年期间发表的47篇有关哺乳动物细胞染色体畸变试验的研究来讨论如何规范化试验条件,并以国家药物安全评价监测中心2002-2017年汇总的背景数据为例阐释建立历史背景数据的要点。总之,严格参考OECD指导原则开展规范化的染色体畸变试验并通过长期积累建立一套对照受试物的背景数据是临床前遗传毒性研究的关键环节,有利于更好地对药物等受试物的潜在致染色体损伤作用进行合理而有效的判断。     

Ames波动试验和GADD45a-GFP GreenScreen两种快速筛选方法评价大黄素和芫花素的遗传毒性

目的 使用Ames波动试验和GADD45a-GFP GreenScreen两种快速筛选方法,对有毒中药芫花和了哥王的主要单体成分大黄素和芫花素的遗传毒性进行评价。方法 （1）Ames波动试验：在非代谢活化（-S9）和代谢活化（+S9）条件下使用鼠伤寒沙门菌TA100开展基于96孔液态培养法的细菌回复性突变试验,大黄素和芫花素（终质量浓度范围均为0.1~10 μg/mL）与菌液充分混合后在37℃下培养72 h。（2）GADD45a GreenScreen高通量筛选试验：在非代谢活化（-S9）和代谢活化条件下（+S9）将表达GADD45a基因的TK细胞（GenM-T01和GenM-C01）与大黄素（0.13~32.0 μg/mL）和芫花素（0.07~16.0 μg/mL）分别作用48 h（-S9）和3 h（+S9）,之后通过酶标仪和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的荧光强度。结果 有无代谢活化条件下,10 μg/mL大黄素均可诱导TA100的回复性突变率显著性升高（P<0.05、P<0.001）;代谢活化条件下,10 μg/mL芫花素可诱导TA100的回复性突变率显著性升高（P<0.001）,16.0 μg/mL芫花素诱导TK6细胞表达的GADD45a-EGFP荧光强度也超过了遗传毒性阈值（1.3倍）。结论 当前研究提示大黄素和芫花素为可疑遗传毒性,需要开展深入研究明确其遗传毒性及机制。Ames波动试验和GADD45a GreenScreen是良好的高通量筛选备选试验,可极大优化浩繁的药物的毒性筛选工作,尤其适宜诸如中药等成分和配伍复杂的药物。     

天然药物成分致突变性风险预测与评价方法研究进展

天然药物成分复杂，无法逐一完成系统的致癌性风险评价及体内遗传毒性试验。鉴于计算机毒理学结合体外致突变风险评价方法在遗传毒性杂质致突变性评价方面的快速发展，也可考虑将此评价模式应用于天然药物成分的致突变性筛选与机制研究。从计算机毒理学和体外致突变性评价两方面出发，综述天然药物致突变性的研究方法，为其遗传毒性试验评价及监管提供借鉴。     

以OATP1B1/OATP1B3转运体为作用靶点的何首乌肝毒性成分筛选

目的 建立以有机阴离子转运多肽1B1（OATP1B1）和OATP1B3为作用靶点的何首乌肝毒性成分快速筛选方法。方法 使用Discovery Studio 2.5软件将何首乌主要单体成分（48个）与OATP1B1/OATP1B3蛋白进行分子对接,以OATP1B1和OATP1B3主要转运底物胆红素作为阳性对照,对目标化合物进行虚拟筛选;采用CCK-8法考察芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（AEG）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（EG）、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（PG）、2,3,5,4''-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSG）处理24 h后对人源肝永生化肝细胞HepaRG的毒性强弱,并采用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）技术测定4种化合物对HepaRG细胞的OATP1B1和OATP1B3 mRNA表达量的影响。结果 与OATP1B1对接结果显示,polygonumnolide B3、cis-emodin-physcionbianthrones、polygonumnolide B2、大黄素甲醚-8-β-D-（6''-O-乙酰基）-葡萄糖苷、trans-emodin-physcionbianthrones、大黄素-3-甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、polygonumnolide B4、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、EG、大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷、AEG、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷高于胆红素打分值的80%,可被初步认定为潜在毒性成分;与OATP1B3对接结果显示,trans-emodin-physcionbianthrones、PG、polygonumnolide A4及虎杖苷高于胆红素打分值的80%,可被初步认定为潜在毒性成分。CCK-8实验进一步证实AEG、EG及PG均具肝细胞毒性作用,半数抑制浓度分别为16.10、49.43、69.44 μg·mL^-1,与分子对接结果一致。与对照组比较,AEG、EG均可显著下调OATP1B1的mRNA表达水平（P<0.05）;PG可显著下调OATP1B3的mRNA表达水平（P<0.05）。结论 以OATP1B1/OATP1B3分子对接技术为切入点,可有效预测何首乌潜在肝毒性成分,实现快速高效的高通量筛选,为中药安全性评价提供新思路。     

大鼠肝彗星试验与骨髓微核试验评价结果比较研究

目的 梳理国家药物安全评价监测中心联合开展的大鼠多终点体内遗传毒性试验数据,比较大鼠肝彗星试验与骨髓微核试验结果的一致性和灵敏性。方法 试验分设阴性物质组、作用机制明确的遗传毒性阳性物质组、受试物组,阴性物质包括超纯水、0.9%氯化钠注射液、玉米油、0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、5%蔗糖和聚山梨酯80,给药体积为10 mL·kg^-1;遗传毒性阳性物质包括200 mg·kg^-1甲磺酸乙酯（EMS）、40 mg·kg^-1N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）、40 mg·kg^-1环磷酰胺、75 mg·kg^-1甲基苄肼、800 mg·kg^-1尿烷、75 mg·kg^-1对氯苯胺、40 mg·kg^-1 1,2-二溴-3-氯丙烷和10 mg·kg^-1秋水仙素;受试物包括100、300、1000 mg·kg^-1大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷,6.5、65.0、650.0 mg·kg^-1单蒽酮和6.5、65.0、650.0 mg·kg^-1大黄素甲醚。分别在实验0、24、45 hig给药1次,给药体积为10 mL·kg^-1。开展大鼠肝彗星试验和骨髓微核试验,计算每只动物的肝细胞刺猬细胞率和尾DNA百分含量（Tail% DNA）,以及每只动物的嗜多染红细胞（PCE）/总红细胞（ERY）比例和嗜多染红细胞微核（MNPCE）率。结果 大鼠肝彗星试验可有效检出DNA断裂剂,对多种烷化剂（甲磺酸乙酯、甲基苄肼和尿烷等）有较好的预测性,但对环磷酰胺和多倍体诱导剂不灵敏。大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、单蒽酮和大黄素甲醚骨髓微核试验结果均为阴性。大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在1 000 mg·kg^-1剂量下导致的肝Tail% DNA与0.5% CMC-Na组比较显著升高（P<0.05）;单蒽酮的肝彗星试验结果为明确阳性,剂量为650 mg·kg^-1时,单蒽酮可导致大鼠肝Tail% DNA显著升高（P<0.05）,且作用存在剂量相关性;大黄素甲醚的肝彗星试验结果为阴性。结论 大鼠肝彗星试验可与骨髓微核试验互补,有效检出主要作用于肝脏且亲电子性较强的遗传毒性化合物。     

基于UGT1A1酶抑制探讨何首乌中顺(反)式二苯乙烯苷体外肝微粒体中潜在毒性作用

目的:以胆红素代谢过程中UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1酶)介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点,考察何首乌中含量高的二苯乙烯苷类(顺式、反式二苯乙烯苷)潜在肝毒性,探索何首乌致肝毒性物质基础。方法:以胆红素为UGT1A1酶底物,以表观抑制常数Ki为评价指标,采用体外肝微粒体孵育法,启动Ⅱ相代谢反应,考察顺式、反式二苯乙烯苷原型成分的抑制作用;启动Ⅰ相代谢反应,考察代谢产物及原型成分的抑制作用,推测待测物的潜在毒性作用。结果:当仅启动Ⅱ相反应时,顺式、反式二苯乙烯苷均以原型形式直接作用于UGT1A1酶,两个单体分别表现出中等抑制和弱抑制作用,抑制类型均为竞争型抑制;当同时启动Ⅰ、Ⅱ两相反应时,两个待测单体对UGT1A1酶的抑制作用均消失,提示两个单体存在Ⅰ相代谢过程,并且其Ⅰ相代谢产物对UGT1A1酶无抑制作用。结论:本实验初步证明何首乌中顺式、反式二苯乙烯苷原型成分对UGT1A1存在抑制作用,经由Ⅰ相代谢后,对Ⅱ相代谢酶UGT1A1抑制作用消失,肝毒性风险降低。     

SD大鼠单次及重复28天给予尿素毒性研究

目的：开展SD大鼠在单次及重复28天经口给予尿素的毒性研究,评价其毒性风险。方法：以尿素为受试物,分别采用单次和重复28天给予2种给药方案。单次给药毒性试验中,将20只SD大鼠分为对照组(给予去离子水)和给药组(给予尿素,10000 mg·kg^-1),受试物经口灌胃给予,之后连续观察临床症状并测定体重,给予尿素后第15天进行大体病理学检查。重复28天给药毒性试验将80只SD大鼠分为4个剂量组,即对照组(给予去离子水)、100 mg·kg^-1组、300 mg·kg^-1组和1000 mg·kg^-1组,每组 20只。连续28天经口灌胃给予受试物,观察动物临床症状,定期测定体重及摄食量。末次给药前进行眼科学检查和尿生化检测;末次给药结束后进行血液学、血液凝固和血清生化学检测,采集脏器称重并进行组织病理学检查。结果：试验期间,所有给药组动物在给药后观察期内均未见异常临床症状。连续给予尿素28天后,给药组动物体重、摄食量与同期对照组比较均未见显著统计学差异(P＞0.05),各项血液学检测、血液凝固和血清生化学检测,所有称重的组织脏器与同性别对照组动物比较均未见显著性差异(P＞0.05),且眼科学检查未见异常,对照组和给药组所有动物的主要组织器官的病理学检查均未见异常。但给予尿素可导致动物尿液中尿蛋白含量升高(P＜0.01)、尿颜色加深(P＜0.01)和尿比重升高 (300 mg·kg^-1组与对照组相比,P＜0.05;1000 mg·kg^-1组与对照组相比,P＜0.01),该现象与给药组动物体内大量尿素经肾脏代谢有关。结论：本研究单次经口给予尿素后未见动物死亡,认为其半数致死率的剂量在10000 mg·kg^-1以上。大鼠对尿素的最大耐受剂量和未见毒性反应剂量均为1000 mg·kg-1。     

亚硝胺类遗传毒性杂质的监管策略及思考

如何对药品中存在致癌风险的亚硝胺类杂质进行控制,已成为企业和监管部门关注的热点。本文对亚硝胺类杂质的常见类型、来源、致癌性作用特点进行梳理,并结合EMA、FDA、ICH及我国相关遗传毒性杂质控制指导原则,对制定符合我国国情的亚硝胺类杂质的监管限度和监管工作提出建议。尽管国外已陆续出台了一系列针对药品中亚硝胺类杂质的含量限定的指南性文件,但众多亚硝胺类杂质的毒性剂量、人体暴露量尚不明确,且药物合成工艺存在差异,我国无法完全照搬欧美等国的监管方法。当前应深入研究亚硝胺类杂质的遗传毒性和致癌性,从而制定符合我国国情的监管限度值和药品中亚硝胺杂质监管策略;此外,本文从解决实际问题的角度出发,讨论如何根据已有指导原则,确定在已知毒理学数据、毒理学数据不足和短期使用药物不同情况下亚硝胺类杂质的监管限度。本文将为药物生产和杂质评价与研究和监管领域相关人员提供借鉴。