大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的体内外遗传毒性评价

目的:评价大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(EG)的体内外遗传毒性,并比较体外细胞试验及大鼠体内实验评价结果的差异。方法:采用体外二维(2D)、三维(3D)细胞培养法分别构建2D、3D HepaRG细胞模型,造模成功后,分别将2D、3D HepaRG细胞分为空白对照组[0.5%二甲基亚砜(DMSO)]、丝裂霉素C组(阳性对照,0.1μg/mL)和EG低、中、高剂量组(10、50、200μg/mL),然后检测各组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量。将SD大鼠分为空白对照组(0.5%羧甲基纤维素钠)、甲磺酸乙酯组(阳性对照,200 mg/kg)和EG低、中、高剂量组(100、300、1 000 mg/kg),每组6只,连续灌胃给药15 d,每天1次;15 d后检测各组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率及外周血淋巴细胞、肝细胞的尾DNA百分含量、尾距。结果:在体外2D HepaRG细胞模型中,与空白对照组比较,丝裂霉素C组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量均显著升高(P<0.01),EG各剂量组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量差异无统计学意义(P>0.05);在3D HepaRG细胞模型中,与空白对照组比较,丝裂霉素C组HepaRG细胞的微核形成率和尾DNA百分含量均显著升高(P<0.01或P<0.001),EG高剂量组HepaRG细胞的尾DNA百分含量显著升高(P<0.01)。在大鼠体内实验中,与空白对照组比较,甲磺酸乙酯组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率和外周血淋巴细胞、肝细胞的尾DNA百分含量、尾距均显著升高(P<0.01),EG高剂量组大鼠外周血淋巴细胞尾DNA百分含量显著升高(P<0.01),EG各剂量组大鼠骨髓嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率和肝细胞尾DNA百分含量、尾距差异无统计学意义(P>0.05),但随剂量增加有升高趋势。结论:本研究结果提示在2D细胞模型中,EG未导致染色体断裂及DNA损伤,但3D细胞模型长期给药和体内重复给药结果均显示EG存在一定DNA损伤风险,故3D HepaRG细胞模型的评价结果更接近大鼠体内实验结果。     

染料溶剂红207的体外致突变风险评价

目的 使用基于鼠伤寒沙门氏菌的Ames波动试验和小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）的体外Pig-a基因突变试验评价新型染料溶剂红207的碱基突变风险。方法 不同质量浓度的溶剂红207（0.625~10.000 μg/mL）分别与TA98和TA100混合于96孔培养板,在37℃条件下作用72 h后判断其对突变菌落数的影响。在优化后的体外L5178Y细胞Pig-a基因突变实验中,溶剂红207（2.5~20.0 μg/mL）分别与L5178Y细胞在有或无S9代谢活化条件下作用24 h或4 h,于给药后第8天评价其是否可诱导哺乳动物细胞Pig-a基因的突变频率增加。结果 无和有S9代谢活化条件下,溶剂红207可导致TA98和TA100回复性突变孔数显著增加（P<0.05、0.01、0.001）,且存在浓度效应相关性,代谢活化后增加更为明显。在非S9代谢活化条件下,溶剂红207各浓度组Pig-a基因突变率与阴性对照组比较无显著性差异;在S9代谢活化条件下,溶剂红207质量浓度范围为2.5~20 μg/mL时,可导致Pig-a基因突变率显著增加（P<0.01、0.001）,且存在浓度效应关系。结论 首次使用体外高通量试验方法评价溶剂红207的致突变风险,发现其存在体外致突变性且经I相代谢活化后致突变性进一步增强。     

符合中药特点的致癌风险评价方法

如何对中药的致癌性风险作出科学而合理的评价是毒理学研究的难点之一。因中药成分和配伍的复杂性,现有的常规遗传毒性评价方法在评价中药方面有所局限。在原有试验原理基础上开发高通量筛选方法,以及利用新型生物标志物和基于新原理的试验技术已在中药毒性预测和评价领域显露一定的应用价值。本文聚焦适合大量成分毒性筛选及靶器官毒性评价的试验方法,包括改良的传统试验方法、自动化检测手段、生物标志物、三维组织培养技术和计算机毒理学的引入等,为中药致癌性评价提供借鉴思路。     

茜素型蒽醌基因突变风险评价

目的 使用毒性预测软件及细菌回复突变（Ames）试验评价茜素型蒽醌的基因突变风险。方法 通过毒性软件Toxtree、Derek Nexus和Sarah Nexus对茜素型蒽醌：茜草素、异茜草素、甲基异茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、茜素-1-甲醚、羟基茜草素、光泽汀进行致突变风险预测;每个受试物设置5个给药浓度,分别在有或无S9代谢活化条件下,使用5种鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA100、TA102、TA1535和TA1537开展基于6孔板培养的Ames试验,判断该类化合物苯环上不同取代基对致突变性的影响。结果 软件基于蒽醌环的存在预测该类化合物均具有致突变风险。在非S9代谢活化下,异茜草素和羟基茜草素可导致TA1537回复突变菌落数增加;光泽汀可诱导TA97、TA100和TA1537回复突变菌落数增加。在S9代谢活化下,异茜草素可导致TA97、TA100和TA1537回复突变菌落数增加;羟基茜草素可导致TA1537回复突变菌落数增加;光泽汀可导致TA97、TA100和TA1537回复突变菌落数增加;甲基异茜草素可导致TA97、TA100、TA102和TA1537回复突变菌落数大幅增加;甲基异茜草素-1-甲醚可导致TA100回复突变菌落数增加。结论 茜素型蒽醌受试物在有或无S9代谢条件下表现出不同程度、不同菌株的回复突变,开展相关研究评价其毒性风险对该类化合物合理监管具有重要价值。     

染料苏丹红的高通量致突变性筛选

目的 初步建立Ames波动试验酶标仪结果判定标准,并对染料苏丹红I~IV的DNA碱基突变风险进行评价。方法 不同浓度的阳性对照2-（2-呋喃基）-3-（5-硝基-2-呋喃基）丙烯酰胺（AF-2）、2-氨基蒽（2-AA）分别作用于鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100后,分别经人工识别或用酶标仪在492和623 nm波长下进行读数,确立基于吸光度的阳性孔判定标准。无或有代谢活化（-S₉）条件下使用鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100开展基于96孔液态培养法的细菌回复性突变试验,苏丹红I~IV终浓度分别为0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 μg/mL。结果 非S₉代谢条件下酶标仪读板结果与人工计数结果一致性达98.1%,S₉代谢条件下酶标仪读数与菌落生长情况无法建立良好关联。在非代谢活化条件下,苏丹红I与IV对TA98的致突变性作用相对较弱;苏丹红I~IV对TA100存在明显的致突变性作用,并呈一定的浓度相关性。在S₉代谢活化条件下,苏丹红III对TA98和TA100均未见致突变作用;苏丹红I在最高浓度10 μg/mL时对2者均有明显的致突变作用,苏丹红IV浓度高于2.5 μg/mL、苏丹红II浓度高于5 μg/mL时,对2者致突变作用均显著。结论 首次使用Ames波动试验检出苏丹红I~IV的基因突变风险,吸光度读数可在非S₉代谢条件下准确判断Ames波动试验结果,为染料的高通量遗传毒性筛选奠定基础。     

微孔板与标准平皿Ames试验比较研究

目的 使用鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌及阳性剂开展基于6孔板、24孔板和标准10 cm平皿的Ames试验，为确立标准化微孔板Ames试验奠定研究基础。方法 6种不同鼠伤寒沙门菌（TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537）和1种大肠埃希菌（WP2 uvrA）经鉴定及扩增后，分别使用标准平皿、6孔板和24孔板在有无S9代谢活化条件下使用不同浓度的阳性剂开展平板掺入法Ames试验。所有样本置37℃培养约48 h后进行菌落计数。结果 所有试验条件下均出现浓度相关性的回复菌落形成率增加，且最高浓度条件下的菌落数高于对照组3倍。然而微孔板中可出现阴性背景菌落数过少的情况，阳性剂的用量也不能照搬标准平皿中的浓度设置。结论 本研究所用条件可成功开展基于6孔板和24孔板的Ames试验，其试验条件和背景数据需要经过摸索与积累。     

尿素遗传毒性评价研究

目的：评价尿素的遗传毒性风险。方法：Ames试验：采用TA98、TA100、TA1535、TA1537和 WP2 uvrA共5种菌株(有和无S9代谢活化)开展,尿素处理剂量为5000、1667、556和185 µg/皿,所有样本置37 ℃培养48 h后进行菌落计数;染色体畸变试验：CHL细胞分别与尿素作用6 h(有和无S9代谢活化)和24 h(无S9代谢活化),尿素处理浓度范围为0.16 ~2.50 mg/mL;细胞经秋水仙素处理后,收获并制片。每组观察100个中期分裂相细胞中含结构畸变和/或数目畸变的细胞数;小鼠骨髓微核试验：单次经口灌胃给予ICR小鼠10000、5000和2500 mg/kg尿素,并在给药24 h和48 h后取材。计数2000个嗜多染红细胞中含微核细胞率。结果：尿素处理组各菌回复突变菌落数与阴性对照组比较均未见明显增加;尿素导致的结构畸变率和数目畸变率与阴性对照组比较均无显著性差异(P＞0.05);给予尿素后24 h,各剂量组平均含微核嗜多染红细胞率与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05),给予尿素后48 h,10000 mg/kg剂量组动物平均含微核嗜多染红细胞率与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。结论：尿素浓度为5000 μg/皿及以下时无诱导细菌碱基突变作用,在无明显细胞毒性作用浓度条件下无诱导哺乳动物细胞染色体结构畸变作用,剂量为10000 mg/kg及以下时无诱导小鼠骨髓细胞染色体损伤作用。故尿素的整体遗传毒性评价结果为阴性。