基础医学实验室仪器设备科学管理的思考

充分发挥基础医学实验室培育人才的重要作用,推动教学科研同步发展,必须不断强化基础医学实验室科学管理,健全仪器设备全生命周期各环节的管理制度,提升实验室仪器设备的使用价值并发挥其效益的最大化。文章结合汕头大学医学院在开展生物化学与分子生物学实验室建设中,强化对本科生人才培养的实践,系统阐述了加强基础医学实验室仪器设备科学管理多个层面上的思考。     

血清DKK1在肿瘤临床应用的价值中

DKK1作为Wnt信号传导通路的拮抗剂,在肿瘤发生发展中发挥重要的作用。近年来的研究表明,DKK1作为一种分泌型糖蛋白,在多种肿瘤患者血清中呈高表达,可能在肿瘤中发挥重要的临床作用。本文就血清DKK1在肿瘤临床应用中的价值作一综述。     

血清DKK1在肿瘤临床应用中的价值

DKK1作为Wnt信号传导通路的拮抗剂，在肿瘤发生发展中发挥重要的作用。近年来的研究表明，DKK1作为一种分泌型糖蛋白，在多种肿瘤患者血清中呈高表达，可能在肿瘤中发挥重要的临床作用。本文就血清DKK1在肿瘤临床应用中的价值作一综述。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

应用毕赤酵母系统表达人Fascin蛋白

背景与目的:应用酵母表达系统表达人的重要肿瘤分子标志物fascin蛋白。材料与方法:利用分子克隆技术将fascin基因完整编码区克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9中,获得重组质粒pPIC9-fascin;以限制性内切酶MssⅠ进行线性化并转化毕赤酵母GS115菌株,用PCR方法筛选出阳性整合克隆;对阳性克隆进行0.5甲醇诱导表达重组蛋白,银染及Western blot检测培养上清中fascin重组蛋白的表达情况。结果:毕赤酵母能够分泌表达约69kD的fascin重组蛋白,表达量为40μg/L。结论:毕赤酵母可以分泌表达fascin蛋白,但由于分泌表达量较低,尚达不到工程化要求。     

高转移潜力食管癌细胞株的建立及其生物学特征

目的建立具有高转移潜力食管癌细胞株并研究其生物学特征。方法将食管癌细胞系EC109细胞悬液异位移植到SCID小鼠胃壁,约3个月后或动物濒临死亡时处死,行病理学解剖,将肉眼可见的纵隔淋巴结转移瘤块接种于SCID鼠皮下扩增,然后取小鼠皮下瘤组织块进行细胞培养,得到性状稳定的细胞株NMC109后,用MTT法分析细胞生长曲线,Western bloting法检测与细胞分裂增殖能力密切相关的TopoIIα表达,酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性,划痕实验和Transwell体外移动实验检测细胞的移动能力。结果与母本细胞EC109相比,所获得的细胞株NMC109其增殖能力和TopoIIα表达明显增强,MMP-9的活性明显升高,移动能力明显增强。结论获得了具有高转移潜力的食管癌细胞株。     

食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定

目的:对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法:应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段,并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic(pGLB)中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK共转染EC109细胞,48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度,并结合生物信息学分析,以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果:用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明,与对照组相比,上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现,在启动子区(-436～ 1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论:在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.     

哺乳动物细胞CDK3系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）在哺乳动物细胞的表达载体,并在真核细胞NIH3T3中进行初步表达。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CDK3编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK3片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,并用蛋白免疫印迹法进行初步的CDK3表达分析。结果：PCR扩增获得约900 bp目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列,全长915 bp;CDK3目的片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP载体,获得相应表达载体;运用构建的表达载体,可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论：成功构建了CDK3系列哺乳动物细胞表达载体,并在NIH3T3中得到表达。