稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5 Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流.方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白.将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348.慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5 Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系.诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析.Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体.无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001).Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带.结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5 Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础.     

SARS-CoV-2 PLpro在对IFN-α应答的肝细胞中独立诱导过度炎症相关坏死性死亡

目的：探讨新型冠状病毒（SARS-CoV-2）木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）在对干扰素α(IFN-α)应答的肝细胞中所介导的功能蛋白质组改变及其效应机制。方法：构建稳定表达PLpro的三株单克隆Huh7肝细胞（PLpro1～3）和对应的空载细胞（NC）,分别以IFN-α刺激各株细胞建立处于IFN-α应答状态的肝细胞模型,采用数据非依赖质谱分析PLpro和NC组的定量蛋白质组,以生物信息学分析,预测PLpro对IFN-α应答性肝细胞的作用机制,并采用RT-qPCR、Western blot、细胞促炎因子水平分析、乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性分析和Annexin V-Alexa Fluor 647/PI凋亡检测等方法对上述机制进行生物学验证。结果：IFN-α可显著上调空载Huh7细胞株（NC细胞）中的ISG化蛋白（P<0.01）,而相同条件下,PLpro细胞蛋白的ISG (IFN-stimulated gene)化修饰被显著下调（P<0.01）,表明PLpro细胞株表达了具去ISG化活性PLpro,提示本研究成功建立了细胞模型。质谱分析鉴定和定量得到5 619个交集蛋白质和1...     

从血透并发症谈血透设备的维护

血液透析是治疗肾功能衰竭最有效的方法,随着各血液净化中心规模的不断扩大,各类血透并发症时有发生.本文针对一些血透并发症对血液透析机及水处理系统的维护进行经验总结及探讨.     

广东菲牛蛭中有效抗凝物质的分离纯化

目的从广东菲牛蛭鲜体中分离纯化有效抗凝物质,并对其生化性质进行测定。方法用水提醇沉、离子交换、反相层析法等分离纯化广东菲牛蛭中的抗凝物质,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白的分子质量,并运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS／MS）进行分析。结果从广东菲牛蛭中分离出得到一种电泳纯的活性多肽,其相对分子质量为19．2kDa。所得菲牛蛭抗凝活性多肽每克蛋白所含单位抗凝活性≥2548000ATU,活性回收率约为53％。结论从广东菲牛蛭鲜体中分离出的活性抗凝多肽对凝血酶具有极强的抑制作用,开发应用前景广阔。     

伤寒肠穿孔13例诊治体会

目的:探讨伤寒并发肠穿孔手术时机对预后的影响,总结诊治经验,提高诊治水平。方法:通过对我院1989年-2005年13例伤寒并发肠穿孔病人的临床资料进行回顾性分析。结果:本组病例均行手术处理,全部治愈。其中,24小时内手术11例,伤口甲级愈合9例,乙级愈合2例。48小时内手术2例。乙级愈合1例,丙级愈合1例。结论:伤寒并发肠穿孔早诊断,早手术,术后合理使用抗生素及支持疗法,能有效减少并发症的发生,降低死亡率。     

封闭式负压引流术治疗人工髋关节置换术后深部组织感染

初次人工髋关节、膝关节置换术后感染发生率为1.5%~2.5%,感染致死亡率为2.5%,感染所需的治疗费用较多。因此,髋、膝人工关节置换术后感染是临床上面临的一大难题。Fleischmann等[1]在1992年首次应用封闭式负压引流术(vacuum sealing drainage,VSD)治疗开放骨折软组织损伤,在控制感染和促进创面愈合方面受到充分肯定。VSD技术的应用可以促     

RF-Ⅱ系统复位加BAK椎间融合器治疗腰椎滑脱10例

我科从2000年10月至2002年8月,采用RF-Ⅱ系统加BAK椎间融合器治疗腰椎滑脱病人10例,取得满意的疗效.     

儿童股骨头无菌性坏死围手术期的护理

目的总结32例股骨头无菌性坏死患儿的临床护理经验。方法对2005年2月-2011年3月收治的32例股骨头无菌性坏死患儿的临床护理措施及方法进行回顾性分析。结果 27例患儿髋关节的功能恢复良好,1例恢复差,4例失随防。结论术前合理的适应性训练,术后加强病情观察,做好石膏、疼痛护理及有计划实施系统的康复训练并及时给予家庭康复护理指导是保证股骨头无菌性坏死患儿顺利康复的重要环节。     

从血透并发症谈血透设备的维护

血液透析是治疗肾功能衰竭最有效的方法,随着各血液净化中心规模的不断扩大,各类血透并发症时有发生。本文针对一些血透并发症对血液透析机及水处理系统的维护进行经验总结及探讨。     

钉棒内固定系统在治疗胸腰段椎体结核中的应用

目的：观察钉棒内固定系统治疗胸腰段椎体结核的临床疗效.方法：自2007～2012年,采用钉棒内固定系统治疗胸腰段椎体结核35例.术前行胸部X线检查排除粟粒性肺结核并完善相关检查排除肿瘤等疑似疾病,行系统抗结核药物治疗2～4周,患者结核中毒症状减轻或消除,血红蛋白＞100 g/L,血沉＜40 mm/h时手术.选择Ⅰ期侧前方减压、病灶清除,椎体间植骨融合并椎弓根钉棒系统内固定,术后继续抗痨治疗6～12个月.结果：本组35例切口全部工期愈合,手术时间90～ 150min,平均100min,术中出血约400～ 650ml,平均约450 ml,术后随访1～2年,内固定物无松动、断裂或脱出,椎体结核全部治愈,术后后凸畸形平均纠正约12°,随访期间畸形纠正无丢失.结论：钉棒内固定系统在治疗不稳定或后凸畸形胸腰段椎体结构中能够Ⅰ期完成病灶清除,脊髓减压,脊柱稳定性重建及后凸畸形矫正作用良好,有助于缩短术后卧床时间,提高治愈率.