陕西省典型冷冻食品中大肠杆菌的分子特征及耐药性检测

为了解冷冻食品中大肠杆菌污染情况,分析其潜在的食品安全问题,从陕西省4 市（宝鸡、咸阳、西安和渭南）共收集冷冻食品样品360 份（120 份速冻水饺和240 份冰淇淋）。通过选择培养和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）进行大肠杆菌分离鉴定。然后对分离株进行21 种毒力基因、23 种耐药基因、15 种抗生素耐药性检测及种群分型。360 份样品中大肠杆菌污染率为13.6%（49/360）,其中5 份样品（10.2%,5/49）大肠菌群计数超过100 CFU/g。21 种被检毒力基因中有9 种毒力基因被检出,以肠外致病性大肠杆菌相关基因FyuA和iss的检出率最高（均为14.3%,7/49）。药敏结果显示,菌株对β-内酰胺类抗生素和叶酸代谢抑制剂的耐药最为普遍（均为98.0%,48/49）,其次为四环素（20.4%,10/49）。其中β-内酰胺类主要编码基因为blaCTX,四环素主要编码基因为tetA。研究还发现1 株分离株携带多黏菌素类抗性基因mcr-9。此外,20.4%的菌株为多重耐药菌株,最多可对13 种抗生素耐药。所有分离株共有4 种系统发育群（A、B1、C和F）,A群为优势群系（63.3%,31/49）。综上,陕西省典型冷冻食品中存在致病性大肠杆菌及耐多药菌株污染,存在通过食物链传播给人的风险。     

陕西省和上海市市售猪肉中金黄色葡萄球菌分子多样性及耐药性研究

为了解市售猪肉中金黄色葡萄球菌的分子多样性和耐药性,本研究对分离于陕西省和上海市的110株猪肉源金黄色葡萄球菌进行15种抗生素耐药性、26种耐药基因、23种毒力编码基因及SPA和MLST分子分型检测。药敏结果显示,菌株对β-内酰胺类和叶酸代谢途径抑制剂的耐药性最为普遍,其次为四环素和大环内酯类抗生素。其中β-内酰胺类抗生素耐药相关基因主要为blaZ、四环素类抗生素耐药相关基因主要为tetK和大环内酯类抗生素耐药相关基因主要为ermB和ermC。分离株耐药性受采样地点和耐药基因影响,分离自上海市分离菌株较陕西省分离株耐药更为严重(P＜0.01)。此外,还检测到2株MRSA菌株。23种被检毒力编码基因中有18种毒力编码基因被检出,其中seg、sei、sem、sen、seo、seu、sea、sep、sed、sej、ser基因携带率较高。陕西省毒力编码基因的携带率85%(34/40)显著高于上海市27.1%(19/70),其中经典肠毒素编码基因的携带率分别为65.0%(22/40)和10.0%(10/70)。所有分离株共有31种克隆型,陕西省的主导分子型为ST6-t701(22.5%,11/40),上海市的主导分子型为ST3055-t084(31.4%,22/70)。此外,分离株携带肠毒素编码基因与分子型有相关性,如ST6-t701高度携带sea,ST7-t091主要携带sep,ST5-t002主要携带seg-sei-sem-sen-seo-seu。结果表明,市售猪肉中金黄色葡萄球菌耐药严重,携带肠毒素编码基因较多,可能通过食物链进行传播。     

肉鸡屠宰环节中金黄色葡萄球菌的流行及分子特征和耐药性

为探究肉鸡屠宰加工环节中金黄色葡萄球菌的污染关键环节及菌株的分子特征和耐药性,对陕西省某肉鸡屠宰场5 个屠宰环节（活鸡肛拭、浸烫、预冷、分割和贮存）进行4 次样本收集。通过选择培养和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增nuc基因对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定。然后对分离株进行23 种毒素编码基因、27 种耐药基因、16 种抗生素耐药性及葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A,SPA）、多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）和肠杆菌科基因间重复序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR）分型检测。结果表明,收集的144 份样本中有32 份样本被污染（22.2%,32/144）。除活鸡肛拭样本无检出外,其余环节样本均有检出。其中浸烫褪毛环节污染率最高（40.0%,12/30）,其次为分割环节（26.7%,8/30）、预冷环节（21.9%,7/32）和贮存环节（15.6%,5/32）。23 种被检毒素编码基因中16 种毒素编码基因被检出,其中pvl、seb、sek、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sep和seq基因常被检出,且96.9%（31/32）的分离株携带新型肠毒素编码基因。27 种被检耐药基因中仅有4 种耐药基因被检出,包括blaZ、tet(K)、erm(B)和aac(6’)/aph(2’’)。16 种所测试抗生素中,菌株对7 种抗生素表现为耐药,其中对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药最为普遍,其次为氨苄西林、青霉素、四环素、环丙沙星、红霉素和庆大霉素。所有分离株共有5 种克隆型（ST7-t091、ST5-t010/t002和ST59-t437/t441）和4 种ERIC-PCR聚类簇（I1～I4）。不同批次样品分离株中存在相同ERIC-PCR图谱、分子型、耐药谱、毒素和耐药基因。结果表明,肉鸡屠宰过程中普遍存在金黄色葡萄球菌污染。且不同环节存在交叉污染现象,其中浸烫被认为是受污染的关键环节。研究还发现,分离株携带肠毒素编码基因与分子型有显著相关性（P＜0.05）。通过对不同环节的监测,有助于识别加工环节污染的关键控制点,可以有效预防及控制食源性疾病的暴发。     

可视化环介导等温扩增法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌

为建立一种快速、简单、灵敏的产志贺毒素大肠埃希氏菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）检测方法,本研究以stx基因作为检测靶基因和利用羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue,HNB）指示剂建立了一种STEC的可视化环介导等温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP）方法。根据GenBank公布的STEC菌株stx1和stx2基因核苷酸序列为靶序列,分别设计并合成五组特异性LAMP引物,优化反应条件和体系,进行特异性和灵敏度试验。同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测方法相比较,并对人工污染STEC的脱脂乳进行检测。结果表明,建立的可视化LAMP方法在64℃反应50 min后可凭肉眼观察（紫罗兰色到天蓝色）判定结果。该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应,可以准确区分STEC与非STEC菌。灵敏度的检测结果表明,stx1-LAMP和stx2-LAMP检测方法的检测限分别为3.54×10-4 ng/μL和3.54×10-5 ng/μL,而常规PCR的检测限stx1和stx2分别为3.54×10-3 ng/μL和3.54×10-2 ng/μL,即stx1-LAMP检测方法的灵敏度是stx1-PCR的10倍,stx2-LAMP检测方法的灵敏度是stx2-PCR的1000倍。对人工污染STEC菌牛奶样品进行检测,stx1-LAMP和stx2-LAMP分别可检测到细菌浓度为103 CFU/mL和102 CFU/mL的加标样品。本研究为STEC菌株提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低,适用于现场和基层检测的可视化LAMP 检测方法。