单增李斯特菌毒力因子多重荧光PCR法 建立与应用

目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)及其3种毒力因子的多重荧光PCR快速检测方法,并应用于日常食品的检测。方法根据单增李斯特菌溶血素基因hly A、内化素基因inl A和表面蛋白act A基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和探针,优化多重荧光PCR反应体系。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果该法特异性强、敏感性高,对单增李斯特菌纯培养物的最低检出限410cfu/m L;重复性好,变异系数均小于2%。对84份食品检测结果与传统国标法相符,共检出单增李斯特菌4份,检出率为4.76%。多重荧光PCR检测方法耗时1 h,比传统方法节约2~5 d。4株单增李斯特菌分离株中2株同时含有inl A、act A、hly A 3种毒力基因,另2株为毒力基因act A缺失株,提示目前流行株并非同一来源。结论本研究建立的多重实时荧光PCR方法能同时对单增李斯特菌及其3种毒力因子进行快速检测,且灵敏度高、特异性好,为食源性疾病的病原学检测提供了快速可靠的方法。     

几种提取转基因木瓜DNA的方法比较

目的 比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果, 以提高转基因木瓜的检测准确率。方法 对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR, 同时对基因表达零件CaMV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR, 以检测提取DNA的质量。结果 分析电泳产物发现, SDS法提取木瓜种籽样品的DNA未能适合普通PCR检测的要求, 其他方法均能满足普通PCR要求。荧光PCR结果显示, 3种方法提取的DNA都满足荧光扩增要求。结论 比较3种提取方法及3种木瓜材料, 发现用CTAB法或SDS法以果皮为材料提取DNA质量最佳。     

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)N1115菌株定量PCR检测方法研究

通过对Lactobacillus paracasei种内的20株菌的全基因组序列进行了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点分析,并结合糖代谢途径预测,序列比对,得到了分辨力可达菌株水平且遗传相对稳定的N1115菌株特异性位点。针对特异性位点所设计的N1115菌株特异性荧光定量PCR扩增引物及探针组,在51株常见益生菌株间具有特异性,所选特异性位点传代8代比较稳定,针对菌粉所建DNA提取方法的定量检出限为10³~10⁹CFU/mL,其间的线性拟合度较好(R2>0.98)。采用已知浓度标准菌粉做标准曲线可以对未知菌含量样品进行准确定量。     

微生物酶制剂中转基因微生物的实时荧光PCR检测方法

针对微生物酶制剂中残留转基因微生物的检测问题,根据醇氧化酶-1(AOX1)启动子基因的序列信息设计一对引物及一条MGB探针,建立了转基因微生物的实时荧光PCR筛选检测方法.实验结果表明,该方法灵敏度达到1pg,可以准确判定生产线上不同分离阶段的微生物酶制剂中的转基因微生物残留情况.该方法准确度和灵敏度高,操作方便,可作为微生物酶制剂中转基因微生物分离状况的监测方法,也可为其他转基因微生物检测研究提供借鉴和参考.     

1株产VB12球形赖氨酸芽孢杆菌C5.1的分离、全基因组测序及分析

为深入探究球形赖氨酸芽孢杆菌C5.1(LysinibacillussphaericusC5.1)菌株产VB₁₂的作用机制,利用PacBio Sequel和Illumina NovaSeq PE150相结合的方法对C5.1菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行拼接、基因预测及功能注释。结果表明,C5.1菌株基因组为一个环状DNA,不含质粒,大小为4 690 817 bp,GC含量为37.21%,预测得到4 756个编码基因,111个tRNA基因和34个rRNA基因。通过基因本体论、直系同源集、京都基因与基因组百科全书和转运蛋白分类数据库对C5.1菌株基因组进行注释分析,分别匹配到3 095、3 182、4 374个和397个基因。进一步分析发现C5.1菌株基因组中包含从尿卟啉原Ⅲ逐步转化合成VB₁₂的关键酶。本研究为解析C5.1菌株在臭腐乳发酵过程中的代谢机理提供遗传信息基础,也为今后开展发酵食品中VB₁₂的生物合成机制研究提供理论支撑。     

多重PCR在调味品致病菌检测中的应用前景分析

食源性疾病是最为重要的食品安全问题之一,加强食源性疾病监测和食品污染物检验是面对这一问题的迫切需要。传统分离培养加生化鉴定检测食源性致病菌的方法,往往操作步骤繁琐耗时,精确度较低、很难满足目前高通量、时间短的要求。尤其是各种调味料品种繁杂,微生物很难扩增,传统方法对致病菌的检出率低。多重PCR技术特异性强、灵敏度高、程序简便易行,自诞生以来,就迅速被广泛地应用于生命科学研究的各个领域,基于该技术的病原菌检测方法已经在国内外广泛开展。文章对近年来基于多重PCR技术的病原菌检测的研究前沿进行了综述,分析了多重PCR方法在调味品致病菌检测中应用优势。内容涉及目标基因、生物芯片技术以及色谱技术和多重PCR的结合、灵敏度提高的方法,同时文章对多重PCR技术在调味品检测中的未来应用的局限、解决方案和前景进行了分析。     

环介导等温扩增法快速检测牛羊肉中的掺杂肉

面对肉制品掺假突发事件频发的现状,对动物源性成分快检方法需求迫切。在等温扩增方法基础上,开展了肉制品掺假鉴定方法研究。以猪、鸡、鸭线粒体细胞色素b基因为目的序列,采用软件Primer Explorer Version5,通过序列比对设计并筛选环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的特异性扩增引物。通过反应体系优化建立猪、鸡、鸭源性成分的环介导等温扩增技术分析方法,对常见9种动物源性成分进行特异性分析,检出限达到0.001 ng/μL,高浓度牛、羊DNA不影响方法检出限。通过分析模板脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)浓度与反应循环数的关系,建立牛羊肉产品中,阈值为1%的猪、鸡、鸭掺杂成分的LAMP快速检测方法,分析时间36 min。采用该方法对深加工模拟掺杂肉样本分析结果与现行国家标准方法结果一致。研究可为肉制品原材料、市售生鲜肉及加工肉制品的肉成分快速筛查提供解决途径。     

基于PCR技术的水貂毛皮鉴别研究

本研究应用荧光PCR技术鉴定水貂毛皮。方法建立:市场采购32件鞣制动物毛皮,提取足够的DNA,应用荧光PCR方法检测水貂成分;其中21件水貂毛皮检测到水貂成分,11件其他动物毛皮均未检出水貂成分,方法特异性达到100%。方法验证:市场采购10件毛皮服装样品,比较宏观法与PCR法结果;其中宏观法鉴定结果与PCR法一致,宏观法无法确定水貂的4件样品均可通过PCR法明确。本方法可用于水貂毛皮的鉴定,并作为宏观法的有效补充和验证。