牛痘病毒GM-CSF注射液中GM-CSF活性及表达量的检测

目的建立牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)注射液中GM-CSF活性及表达量的梯度分析法。方法采用TF-1细胞增殖法,四参数方程拟合检测不同浓度梯度样品的GM-CSF生物学活性;采用ELISA法,二次方程拟合检测不同浓度梯度样品的GM-CSF表达量。结果牛痘病毒GM-CSF注射液及标准品的浓度与GM-CSF的生物学活性呈量效依赖关系,随着GM-CSF浓度的增加,其GM-CSF的生物学活性增强,数据经四参数方程拟合后呈S型曲线,相关系数分别为0.953和0.997,将剂量反应曲线中直线部分的浓度对数和相应的吸光度值作直线回归,两回归线的斜率b之间差异无统计学意义(P0.05);用该方法检测1批牛痘病毒GM-CSF注射液感染上清中GM-CSF活性,平均值为(181±16)GCU,变异系数为8.84%。牛痘病毒GM-CSF注射液及标准品的浓度与GM-CSF表达量呈量效依赖关系,随着稀释倍数的增加,GM-CSF的表达量也降低,采用二次方程进行拟合,r2均﹥0.99;用该方法检测1批牛痘病毒GM-CSF注射液感染上清中GM-CSF表达量,均符合表达量与感染浓度成正比升高的规律和趋势,且均15 ng/m L。结论建立的方法稳定、可靠、适用性强,能表明病毒感染量与GM-CSF表达活性及表达量间的量效关系,对同类产品的质量控制具有借鉴意义。     

重组人促红素的异构体比例及体内比活性分析

目的分析12家企业生产的重组人促红素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的异构体比例及体内比活性。方法用全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测12家企业的rhEPO原液的异构体,按《中国药典》三部(2015版)方法测定rhEPO原液的体内比活性,同时采用多元回归及聚类分析等统计学方法分析各企业间rhEPO的相似性。结果按等电点区分并定义各异构体,在等电点3.6~5.1范围内,依次定义为异构体1~9。不同生产企业的rhEPO具有不同的异构体构成特征,主要异构体峰有5~8个,其中异构体4~7占比较高。各生产企业rhEPO原液的体内比活性相近,约为1.0×10~5 IU/mg。拟合获得九元多元回归线性方程S=0.00 P_1+3.18 P_2+1.71 P_3+1.21 P_4+0.98 P_5+0.93 P_6+1.16 P_7+0.66 P_8+0.00 P_9(S代表总体内比活性,S_i代表各类异构体体内比活性,P_i代表各类异构体的比例,体内比活性的单位为1.0×10~5 IU/mg),R~2=0.914 0。12个生产企业的rhEPO比较相近,其中厂家2和8最为相似。结论12个生产企业的rhEPO具有不同的异构体构成特征,体内比活性约为1.0×10~5 IU/mg,且各企业制品间比较相似。     

重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因治疗制剂的质量分析

目的对重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(recombinant adeno-associated virus 2 encoding tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,r AAV2-TRAIL)基因治疗制剂进行质量分析,并针对其关键质量属性建立质控方法。方法采用PCR法对r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中插入的启动子CAG和目的基因TRAIL进行鉴别;在腺病毒(Ad5)的辅助下,将r AAV2-TRAIL体外感染293T细胞后,采用ELISA法检测培养上清中目的蛋白TRAIL的表达量,检测r AAV2-TRAIL对神经胶质瘤U251细胞的体外杀伤活性;设计引物及探针,采用Q-PCR法检测r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中的r AAV2-TRAIL滴度、可能存在的复制型rc AAV滴度以及残余辅助病毒1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV1)滴度。结果启动子CAG和目的基因TRAIL的PCR鉴定结果与理论及理化对照品相符;r AAV2-TRAIL感染293T细胞48 h后,上清中TRAIL表达量为(0.36±0.18)ng/ml,RSD为50.0%;r AAV2-TRAIL体外作用于神经胶质瘤细胞U251,细胞生长相对抑制率为(26.6±3.75)%,RSD为14.1%;制剂中r AAV2-TRAIL滴度为(4.72×1011±0.52×1011)copies/ml,RSD为11.0%,rc AAV滴度为(2.49×107±0.18×107)copies/ml,RSD为7.2%,HSV1滴度为(6.02×106±0.51×106)copies/ml,RSD为8.5%。r AAV2-TRAIL/rc AAV为1.90×104,r AAV2-TRAIL/HSV1为7.84×104。结论建立的质控方法可用于r AAV2-TRAIL的质量控制,为该产品质量标准的建立奠定了基础,同时对以AAV为载体的基因治疗制剂的质量研究提供参考。     

重组人CTAL4-Ig活性测定参考品的制备及标定

目的　建立用于效价测定的重组人CTAL4 Ig参考品。方法　按WHO标准品有关要求制备参考品 ,分装、冻干后进行检测 ,采用Raji细胞体外活性测定法进行标定。结果　冻干重组人CTAL4 Ig参考品经检测外观、无菌实验合格 ,水分为 2 2 % ,经 10次标定活性值位于 336～ 4 6 3U/支 ,平均值为 4 19U/支 ,10次结果的标准差为36 0 3U/支 ,变异系数为 8 6 1% ,加速热稳定实验表明其生物学活性在 - 2 0℃、4℃和 2 5℃下 12个月保持稳定。结论　该批重组人CTAL4 Ig活性参考品各项指标均符合标准品的要求 ,效价定为 4 0 0AU/支 ,编号为 2 0 0 2 /0 1。     

抗DNA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其抗体的鉴定

目的制备抗DNA单克隆抗体,用以建立特异、灵敏、简便的外源性DNA残留量测定方法。方法将小牛胸腺DNA与阳离子化的牛血清白蛋白通过Mannich反应连接成为完全抗原,免疫BALB/c小鼠得到的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,获得稳定分泌抗DNA单抗的杂交瘤细胞株,对抗体进行纯化、浓缩及鉴定。结果得到3株可稳定分泌抗DNA单抗的杂交瘤细胞株,单抗的ELISA间接效价分别为1∶4×103、1∶8×104和1∶1×103;亚型分别为IgM/κ、IgM/λ和IgM/κ;亲和力常数分别为3.96×108、4.04×109和1.26×108L/mol;3株细胞分泌的单抗与ctDNA、DH5αDNA、GS115DNA和H.S.DNA均有较高的结合能力,而对RNA、BSA和酪蛋白结合较弱或不能结合;3株细胞分泌的单抗识别3个不同的抗原表位;可检出4ng/ml以上的DNA。结论成功制备了3株细胞分泌的抗DNA单抗,为外源性DNA残留量免疫测定方法的深入研究奠定了基础。     

毛细管SDS无胶筛分电泳测定小分子多肽相对分子质量

目的建立快速毛细管SDS无胶筛分电泳法(SDS-NGS),测定小分子多肽相对分子质量。方法涂层毛细管(管长30cm,内径100μm);分离电压为9kV(300V/cm),分离温度为20℃;检测波长为214nm,检测时间为18min;所用SDS-多肽相对分子质量标准范围为2 512~16 949;以橙G(OG)为内标参照物。结果在相对分子质量2512~16949范围内,多肽相对分子质量的对数与其相对迁移率具有良好的线性关系(r=0.996);应用该方法测定了重组人奈西立肽、重组人表皮生长因子、虎纹镇痛肽、重组人心钠肽4种重组小分子多肽的相对分子质量,所测结果变异系数CV均小于3%。结论毛细管SDS无胶筛分电泳方便快速,灵敏度高,重现性好,结果准确,可作为小分子多肽相对分子质量的检测方法。     

HPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定重组人白细胞介素-11的一级结构

用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素-11（rhIL-11)的一级结构。利用电喷雾四极杆飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS）测定rhIL- 11的精确分子质量，采用高效液相-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术（HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）测定其胰蛋白酶酶切后肽段的部分氨基酸序列并结合数据库检索进行结构鉴定。rhIL-11的实测分子质量为19 047.38 u，与理论分子质量19 047.29 u相比非常接近。HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS测定 m/z 664.45、m/z 609.40的肽段的部分氨基酸序列分别为Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu和Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu。将这两段序列在MASCOT数据库检索，结果表明rhIL-11的结构正确。     

重组F基因缺失型仙台病毒hFGF2基因治疗制剂质控方法及质量标准的建立

目的建立搭载2型人成纤维细胞生长因子(human fibroblast growth factor 2,h FGF2)重组F基因缺失型仙台病毒(Sendai virus,Se V)制剂(Se V-h FGF2/d F)的质控方法与质量标准。方法采用RT-PCR法对Se V载体中插入的目的基因h FGF2和缺失的F基因进行鉴别,同时扩增两个基因片段M-HN和h FGF2-NP,以鉴别该病毒;鸡红细胞凝集试验检测制品的血凝效价,并计算病毒颗粒数;免疫荧光法测定Se V-h FGF2/d F的感染滴度,结合病毒颗粒数计算其比滴度;Se V-h FGF2/d F体外感染COS7细胞后,ELISA法测定感染上清中h FGF2的表达量;将感染上清体外作用于BALB/c 3T3细胞,3T3细胞增殖法检测h FGF2的生物学活性;酚-氯仿法抽提样品的DNA,Pico-Green法测定制品中DNA残留量;PCR法检测腺病毒残留。结果重组Se V-h FGF2/d F基因组中h FGF2基因、F基因、M-HN片段和h FGF2-NP片段的RT-PCR鉴定结果与理论值相符;血凝效价为1∶512,病毒颗粒数为4.12×1010 VP/ml;感染滴度为2.06×109 CIU/ml,比滴度为5.0%;Se V-h FGF2/d F以MOI 10感染COS7细胞72 h后,ELISA检测上清中h FGF2的表达量为117.1 ng/ml;表达上清中h FGF2的生物学活性为437 IU/ml;DNA残留量为2.24 ng/ml;制品中腺病毒的PCR检测结果为阴性;其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及《中国药典》三部(2010版)要求。结论初步建立了Se V-h FGF2/d F的质控方法和质量标准,为保证该制品的安全、有效、质量可控奠定了基础,同时也为其他Se V载体基因治疗药物的质量控制提供了参考。     

我国生物技术产品的发展战略

<正>随着生物技术的快速发展和人类基因组计划等的相继展开，生物技术的发展呈现出前所未有的巨大活力。目前，我国正在实施的国家科技攻关计划。“863”计划、自然科学基金、火炬计划等均把生命科学和生物技术放在重要的地位，极大地促进了我国生物技术产业的发展和成熟。随着WTO的加入，必将对我国制药行业带来极大的挑战，进口制品将会大量增加，对我们的市场势必形成极大的冲击。因此，我们必须面对世界性的挑战，将其转化为发展的机遇和动力，加速我国制药行业的发展。现将我国医药生物技术产品的现状和发展战略简介如下。     

睫状神经营养因子突变体的克隆、表达、纯化及生物学活性

目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。