重组人促红素的异构体比例及体内比活性分析

目的分析12家企业生产的重组人促红素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的异构体比例及体内比活性。方法用全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测12家企业的rhEPO原液的异构体,按《中国药典》三部(2015版)方法测定rhEPO原液的体内比活性,同时采用多元回归及聚类分析等统计学方法分析各企业间rhEPO的相似性。结果按等电点区分并定义各异构体,在等电点3.6~5.1范围内,依次定义为异构体1~9。不同生产企业的rhEPO具有不同的异构体构成特征,主要异构体峰有5~8个,其中异构体4~7占比较高。各生产企业rhEPO原液的体内比活性相近,约为1.0×10~5 IU/mg。拟合获得九元多元回归线性方程S=0.00 P_1+3.18 P_2+1.71 P_3+1.21 P_4+0.98 P_5+0.93 P_6+1.16 P_7+0.66 P_8+0.00 P_9(S代表总体内比活性,S_i代表各类异构体体内比活性,P_i代表各类异构体的比例,体内比活性的单位为1.0×10~5 IU/mg),R~2=0.914 0。12个生产企业的rhEPO比较相近,其中厂家2和8最为相似。结论12个生产企业的rhEPO具有不同的异构体构成特征,体内比活性约为1.0×10~5 IU/mg,且各企业制品间比较相似。     

牛痘病毒GM-CSF注射液中GM-CSF活性及表达量的检测

目的建立牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)注射液中GM-CSF活性及表达量的梯度分析法。方法采用TF-1细胞增殖法,四参数方程拟合检测不同浓度梯度样品的GM-CSF生物学活性;采用ELISA法,二次方程拟合检测不同浓度梯度样品的GM-CSF表达量。结果牛痘病毒GM-CSF注射液及标准品的浓度与GM-CSF的生物学活性呈量效依赖关系,随着GM-CSF浓度的增加,其GM-CSF的生物学活性增强,数据经四参数方程拟合后呈S型曲线,相关系数分别为0.953和0.997,将剂量反应曲线中直线部分的浓度对数和相应的吸光度值作直线回归,两回归线的斜率b之间差异无统计学意义(P0.05);用该方法检测1批牛痘病毒GM-CSF注射液感染上清中GM-CSF活性,平均值为(181±16)GCU,变异系数为8.84%。牛痘病毒GM-CSF注射液及标准品的浓度与GM-CSF表达量呈量效依赖关系,随着稀释倍数的增加,GM-CSF的表达量也降低,采用二次方程进行拟合,r2均﹥0.99;用该方法检测1批牛痘病毒GM-CSF注射液感染上清中GM-CSF表达量,均符合表达量与感染浓度成正比升高的规律和趋势,且均15 ng/m L。结论建立的方法稳定、可靠、适用性强,能表明病毒感染量与GM-CSF表达活性及表达量间的量效关系,对同类产品的质量控制具有借鉴意义。     

转基因生物反应器在生物制药领域的应用

随着重组抗凝血酶Atryn和重组人C1酯酶抑制剂Ruconest在美国和欧盟分别获批,转基因生物反应器在生物制药领域受到了更多的重视。转基因生物反应器主要包括转基因动物的乳汁、血液、尿液、精液及蛋清等。应用转基因生物反应器,可降低药物生产成本,提高产量,且安全性更高。本文就转基因生物反应器在生物制药领域的研究和应用现状作一综述。     

三氟乙酸及甲酸体系下重组人促红素液质肽图的比较

目的探讨流动相中添加三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)或甲酸(formic acid,FA)时,重组人促红素(erythropoietin,EPO)液质肽图中各肽段的保留时间、峰面积及离子化效率的差异。方法将重组人EPO样品进行酶切,分别在含0.1%TFA及0.1%FA的流动相体系下测定液质肽图。通过分析质谱数据对各色谱峰进行定性,记录并计算各肽段的保留时间、峰面积及质谱信号强度。结果两种添加剂体系下,各肽段的保留时间存在差异,大部分肽段的保留时间变化在1 min左右,个别肽段超过2 min;TFA体系下各肽段的峰面积相对较小,约为FA体系下的84%;FA体系下各肽段离子化效率较高,信号强度一般为TFA体系的6倍,个别肽段高达10倍以上。结论两种体系下重组人EPO的液质肽图存在较大差异,应根据实验目的选择合适的流动相添加物。     

重组人表皮生长因子与其衍生物功能和结构对比分析

目的对比分析重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rh EGF)与重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF derivative,rhEGFd)的比活性和结构。方法采用《中国药典》三部(2015版)通则中3T3细胞/MTT显色法检测rhEGF和rhEGFd的生物学活性,新建的凝胶色谱法检测成品中主药蛋白质含量。计算比活性并分析结构与功能的关系。结果 rhEGFd的比活性明显高于rhEGF(P0.05),约为rhEGF的1.48倍。结论对比分析了rhEGF和rhEGFd的比活性和结构,为其质量标准的完善提供了支持。     

冻存对复溶后人粒细胞刺激因子国家标准品生物学活性的影响

目的 探讨冻存对复溶后人粒细胞刺激因子（human granulocyte colony-stimulating factor,hG-CSF）国家标准品生物学活性的影响，为hG-CSF国家标准品的使用提供参考。方法 依据《中国药典》三部（2020版）通则3525测定标准品的生物学活性；将复溶后的hG-CSF国家标准品分装后置于-80、-40、-20℃保存，分别于第1、2、3、5和6个月取样检测生物学活性，用临用前复溶的标准品定量-80℃存放不同时间的标准品，以-80℃存放的样品为100%活性对照品定量其余样品的相对生物学活性。结果 热加速稳定试验拟合Eyrlng方程为：ln{k(t)}=6.75-3 772.20/T+ln(T),R2=0.969，预测hG-CSF国家标准品于-80℃贮存时，生物学活性衰减5%约需93.4个月；-80℃冻存的复溶标准品生物学活性值下降约24%。结论 hG-CSF国家标准品复溶分装后于-80℃可稳定保存半年以上。但冻融会引起活性值下降超过20%，因此不建议复溶后分装储存使用。