壳聚糖载体在经鼻粘膜免疫中的作用

壳聚糖是一种主要从贝壳中提取的天然阳离子多聚糖,作为一种非病毒载体系统,在经鼻免疫中的优良作用已被许多研究所证明。本文就壳聚糖载体在经鼻免疫中作用机制、剂型、应用作一综述。     

血小板源性生长因子对人牙周韧带细胞在壳聚糖-磷酸三钙支架材料上附着和增殖的影响

目的:研究血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)对人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)在壳聚糖-磷酸三钙(chitosan/tricalcium phosphate,CTCP)支架材料上附着和增殖的影响。方法:将一定体积的CTCP支架材料置96孔培养板内,取第5代hPDLC接种在材料表面。实验组加入含PDGF-BB的DMEM培养液,使得PDGF-BB终浓度分别为1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL;对照组仅加入DMEM培养液。孵育24h及72h后分别对材料上的细胞计数;72h后对标本行扫描电镜观察。结果:与对照组相比,各浓度PDGF-BB组培养24h后均可促进hPDLC在CTCP支架材料上的附着,呈浓度依赖关系,差异具有统计学意义(P<0.05),其中100ng/mL为最有效浓度;同时培养72h后各浓度PDGF-BB组均能促进hPDLC在CTCP支架材料上的增殖,差异具有统计学意义(P<0.05);扫描电镜观察发现PDGF-BB组较对照组hPDLC在材料上附着数量增加,伸展更充分。结论:hPDLC在CTCP支架材料上的附着和增殖可被PDGF-BB所增强。     

大鼠骨髓基质细胞与胶原-壳聚糖复合后修复牙槽骨缺损的研究

目的：以大鼠骨髓基质细胞为种子细胞，胶原一壳聚糖复合物为支架材料，通过骨组织工程的原理和方法修复牙槽骨缺损。方法：将28只SD大鼠分为实验组和对照组，实验组取大鼠骨髓基质细胞进行体外培养并矿化诱导为成骨样细胞，植入胶原一壳聚糖复合物培养1周后，植入大鼠下颌骨缺损处，2周、4周后取材。对照组细胞未进行诱导。结果：骨髓基质细胞矿化诱导后表现出与成骨细胞相似的形态学与功能表现，ALP染色阳性，并形成矿化结节，细胞在胶原一壳聚糖复合物内伸展良好，组织学观察：实验组2周后可见有少量新骨形成，4周后新骨形成面积增大对照组无明显新骨形成，材料周围有炎细胞浸润。并可见部分纤维结缔组织包绕。结论：利用胶原一壳聚糖复合物与诱导后的BMSC复合有良好的新骨形成能力。对临床修复唇腭裂骨缺损并进行正畸治疗有良好的应用前景。     

羧甲基壳聚糖复合奥硝唑后对口腔重要厌氧菌增效抑菌作用的评价

壳聚糖由甲壳类生物的外壳经加工提取而成。羧甲基壳聚糖是壳聚糖的衍生物,是一种良好的药物载体[1]。本试验选择口腔4种重要厌氧菌进行抑菌浓度(MIC)测定,评价羧甲基壳聚糖复合奥硝唑后对口腔厌氧菌的抑菌性能1材料与方法1.1试验菌株牙龈卟啉菌(P.g)ATCC33277、放线共生放线菌     

幽门螺杆菌重组蛋白PLGA微球和PLGA-壳聚糖复合微球的制备及其释放性能研究

  目的  制备载有幽门螺杆菌重组蛋白（BIB蛋白）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid, PLGA）微球和PLGA-壳聚糖复合微球,优化微球制备参数,并分析两种微球在体外胃、肠液中的释放性能。  方法  采用双乳化-溶剂挥发法（W1/O/W2）制备BIB-PLGA微球和BIB-PLGA-壳聚糖复合微球;通过单因素分析方法,研究水相/油相（W1/O）比例、PLGA质量分数、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）浓度等对微球外观、粒径、分散指数（polydispersity index, PDI）、包封率和载药率的影响,确定最优参数,采用BCA法测定蛋白浓度,计算微球累计释放率。  结果  本研究的最佳参数条件为:W1/O为1∶2,PLGA质量分数5%,PVA质量分数0.2%。BIB-PLGA微球包封率（78.20±1.73）%,载药率（10.58±0.23）%,粒径（2.11±0.08） μm,PDI（0.35±0.18）;BIB-PLGA-壳聚糖复合微球包封率（78.87±1.30）%,载药率（15.50±0.25）%,粒径（2.28±0.52） μm,PDI（0.39±0.54）。BIB-PLGA微球和BIB-PLGA-壳聚糖复合微球在体外胃、肠液中均能缓慢释放,BIB-PLGA-壳聚糖复合微球的缓释效果更明显。  结论  采用双乳化-溶剂挥发法制备的BIB-PLGA微球和BIB-PLGA-壳聚糖复合微球载药率和包封率都较高,粒径可控,外观分散,对胃肠液有缓释作用。     

装载黄芩苷的溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖纳米凝胶的制备及表征

目的基于蛋白-多糖纳米凝胶的制备技术,通过低相对分子质量壳聚糖对溶菌酶的修饰以及对环境因素的调节筛选,控制溶菌酶的自组装行为,制备一种绿色环保的具备核壳结构的溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖纳米凝胶,从而达到减小粒径,提高包封率和载药量的目的,使其更有利于肾靶向。方法利用Maillard反应将溶菌酶与低相对分子质量壳聚糖按不同比例合成溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖枝接物,通过SDS-PAGE蛋白电泳来优选出产量最高的合成比例;对合成的产物进行内源荧光、紫外测定等表征,并通过2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid,TNBS)法测定接枝率;以粒径为评价指标,对溶菌酶浓度,反应体系pH值、加热温度等条件进行筛选优化,得到空白纳米凝胶最佳合成条件;选取适宜的载药方法,得到了载黄芩苷纳米凝胶。结果合成纳米凝胶的最佳工艺为溶菌酶与低相对分子质量壳聚糖比例1∶2、反应体系pH值11、溶菌酶-壳聚糖接枝物质量浓度为0.6 mg/mL、加热温度71℃、加热时间51 min。得到的溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖枝接物接枝率为(24.7±2.9)%,空白纳米凝胶的粒径范围为16～120 nm、平均粒径为49.02 nm、PDI为0.132,载黄芩苷纳米凝胶的包封率为(95.00±2.54)%、载药量为(17.00±1.26)%。结论通过Maillard合成了溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖纳米凝胶,并找到了最优的合成工艺。制备的纳米凝胶包封率高,粒径小,分布均匀,缓释效果明显。     

胶原基组织工程支架对成纤维生长因子的控制释放与组织再生功能

目的通过将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与胶原基组织工程支架进行复合,实现对bFGF的控制释放,从而更有效的实现组织再生功能.方法采用ELISA酶联免疫试剂盒对溶出的bFGF进行定量分析,考察支架对bFGF的短期控制释放过程.结果bFGF可以通过静电作用与胶原基支架结合,均匀分布在多孔三维支架中,48 h后,bFGF的溶出浓度趋于恒定,经过甲醛交联的支架对bFGF的结合量较高;bFGF的结合量受到壳聚糖的含量和交联方法的影响.结论胶原基组织工程支架能够对生长因子在较长时间内实现控制释放,促进组织的再生修复.     

12-烷基化壳聚糖纳米粒包裹反义内皮素转换酶核酸表达质粒在哮喘基因治疗中的特征

目的:气道给予12-烷基化壳聚糖纳米粒包裹的反义内皮素转换酶核酸表达质粒,观察对卵清蛋白致敏的小鼠变应性气道炎症的影响,并与裸DNA组小鼠作比较。方法:实验于2004-03/2006-02在广州医学院第一附属医院海印分院15楼实验室完成。①40只Balb/c小鼠采用随机数字法分为4组,每组10只。②12-烷基化壳聚糖纳米粒的制备:将12-烷基化壳聚糖纳米絮状物溶于0.05mol/L醋酸钠/0.05mol/L醋酸溶液中,浓度0.02wt%,将反义内皮素转换酶核酸溶于25mmol/L的Na2SO4溶液中,浓度0.01wt%,按烷基化壳聚糖与反义内皮素转换酶核酸按不同质量比制备包裹反义内皮素转换酶核酸的12-烷基化壳聚糖纳米粒。③凝胶阻滞实验:为检测pH值对DNA结合力的影响,在pH=3,4,5,6,7,8时,反义内皮素转换酶核酸与12-烷基化壳聚糖纳米粒按质量比为1∶2,4,8的比例混合;为检测不同质量比时12-烷基化壳聚糖纳米粒对DNA结合力的影响,在pH=6时,反义内皮素转换酶核酸与12-烷基化壳聚糖纳米粒按质量比为1∶0.5,1,2,4,8,16,32的比例混合;反义内皮素转换酶核酸的浓度恒定为1g/100L,10g/L琼脂糖凝胶电泳60V电泳1h。④包裹反义内皮素转换酶核酸的12-烷基化壳聚糖纳米粒治疗组(纳米粒治疗组)、卵清蛋白致敏激发组、卵清蛋白致敏激发并给予裸DNA组(裸DNA组)于第0天与第14天每只小鼠分别腹腔注射卵清蛋白致敏液0.2mL,生理盐水对照组注射等体积的生理盐水;前3组于第24,25,26天,以10g/L卵清蛋白溶液8mL雾化吸入。生理盐水对照组用等体积生理盐水雾化作为对照。纳米粒治疗组、卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组于激发前24h分别给予气道灌注包裹反义内皮素转换酶核酸的12-烷基化壳聚糖纳米粒75μL、生理盐水75μL和反义内皮素转换酶核酸5μg加生理盐水(总量75μL),生理盐水对照组灌注生理盐水75μL。⑤末次激发后24h进行支气管肺泡灌洗,计算支气管肺泡灌洗液中细胞总数、分类计数。肺组织病理切片,苏木精-伊红染色,观察各组小鼠肺组织的病理变化。ELISA法检测肺组织匀浆上清白细胞介素4、白细胞介素5、干扰素-γ和内皮素1水平。结果:小鼠40只小鼠全部进入结果分析。①凝胶阻滞实验结果:12-烷基化壳聚糖纳米粒在pH7以下均能很好地与反义内皮素转换酶核酸结合,但是在pH为8时,显示结合不完全;在12-烷基化壳聚糖纳米粒与反义内皮素转换酶核酸质量比为1∶1时,全部反义内皮素转换酶核酸被结合。②各组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞学检查结果:与生理盐水对照组小鼠相比,卵清蛋白致敏激发组、裸DNA组和纳米粒治疗组细胞总数、Eos百分比与Eos绝对计数均升高(P<0.01)。纳米粒治疗组上述3种指标均显著低于卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组小鼠(P<0.01或P<0.05)。③各组小鼠肺组织病理改变:纳米粒治疗组肺部炎症改变较卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组有所减轻,但较生理盐水对照组还是有所加重。④各组小鼠肺匀浆上清细胞因子检测结果:生理盐水对照组内皮素1、白细胞介素4,5水平均明显低于纳米粒治疗组、卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组(P<0.05或P<0.01),而纳米粒治疗组以上各细胞因子水平则明显低于卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组[白细胞介素4各组依次为:(70.7±17.9),(107.7±20.6),(108.66±19.0)ng/L,白细胞介素5各组依次为:(55.4±7.0),(64.3±8.5),(66.4±6.9)ng/L,内皮素各组依次为:(18.5±1.4),(28.9±2.3),(27.1±1.6)ng/L,P<0.05或P<0.01]。结论:①12-烷基化壳聚糖纳米粒包裹的反义内皮素转换酶核酸能够成功在小鼠气道表达,通过RNAi干扰内皮素转换酶生成,阻滞大内皮素转换为活性内皮素,减少内皮素的合成,减轻变应性气道炎症。②而卵清蛋白致敏激发并给予裸DNA组与卵清蛋白致敏激发组比较差异无显著性,表明裸DNA难以通过气道内注入在活体动物气道表达。     

Box-Behnken效应面法优化大黄素/小檗碱-壳聚糖双载药纳米粒的处方工艺研究

目的优化大黄素(Emo)与小檗碱(Ber)壳聚糖双载药纳米粒的制备工艺和处方,并考察其稳定性及溶出度。方法以壳聚糖(CS)为载体,三聚磷酸钠(TPP)为交联剂,采用离子交联法包载大黄素/羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和小檗碱,得到载药纳米粒(Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs),以粒径和多分散指数(PDI)为自变量,运用总评归一值(OD)法进行数据处理,采用Box-Behnken效应面法优化处方并进行验证。最后对纳米粒的最佳冻干条件进行筛选,考察保护剂种类和用量。并对制剂进行表征和溶出度考察。结果优化得到的最佳制备工艺为壳聚糖与TPP质量比为3∶1,小檗碱与载体质量比为0.166∶1,Emo/HP-β-CD与载体质量比为0.2∶1。测得Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs的平均粒径为(178.0±2.0)nm,PDI为0.187±0.006,平均OD值为0.9536,实测值与预测值接近。大黄素和小檗碱的载药量分别为0.34%和0.95%。稳定性考察结果表明,纳米粒胶体溶液在9 d内以4℃储存物理性质稳定,以6%葡萄糖为保护剂制得的冻干制剂效果较好,复溶迅速,再分散后的平均粒径为(161.8±4.8)nm,PDI为0.263±0.047。体外释放研究表明载药纳米粒冻干粉溶解度和溶出度显著提高。结论Box-Behnken效应面法所建立的模型能较好的用于Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制剂的处方优化,精度高,预测效果较好,且Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制备工艺稳定可行。