乙型肝炎病毒复制对肝癌细胞Arid2基因表达的影响

目的:初步研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染及其复制对肝癌细胞中抑癌基因Arid2(AT-rich interactive domain 2)表达的影响。方法:采用携带HBV基因组1.1倍体的复制型重组腺病毒Ad-HBV1.1感染Huh7细胞,或者四环素诱导的HBV复制细胞模型Hep AD38细胞,观察HBV瞬时或稳定复制细胞模型中Arid2的表达变化;进一步采用HBV各元件乙型肝炎病毒S蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBV-pol)、乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的过表达质粒转染Huh7细胞,明确病毒自身编码蛋白对Arid2表达的调控作用。在上述细胞模型中,运用Southern-blot、ELISA、real-time PCR的方法验证HBV的感染与复制情况,通过RT-PCR、Western blot检测肝癌细胞抑癌基因Arid2表达水平的变化。结果:HBV瞬时转染或稳定复制细胞模型中,Ad-HBV1.1感染的Huh7细胞m RNA和蛋白表达水平明显降低,Western blot结果显示Arid2蛋白表达水平降低了46.10%(P<0.05);在HBV稳定复制的Hep AD38细胞中,Arid2蛋白表达水平降低了37.63%(P<0.05)。转染HBV 4种病毒编码蛋白过表达质粒的Huh7细胞中,过表达HBs、HBx组较其他实验组Arid2表达水平明显降低,Western blot结果显示Arid2蛋白表达水平在HBs组降低了54.55%(P<0.05),在HBx组降低了46.38%(P<0.05)。结论:HBV的感染和复制导致肝癌细胞中Arid2的表达水平下调,Arid2基因的表达与HBV复制水平呈负相关,其中HBs、HBx对Arid2的下调作用较明显。     

设计特异性结合HBV X基因启动子的人工锌指蛋白以抑制HepG2.2.15细胞中HBV的转录

目的：设计人工锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）特异性结合于乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBX）基因启动子,观察ZFP在体外对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）转录的抑制。方法：将pcDNA3.1-ZFP转染入HepG2.2.15细胞24 h后,用Western blot检测HBX蛋白的含量;用ELISA和real-time PCR检测上清液中乙型肝炎核心相关抗原（hepatitis B e antigen,HBeAg）和HBV DNA含量,用RT-PCR检测胞内HBV mRNA水平。结果：ZFP可抑制HepG2.2.15细胞中HBX的表达;相比空质粒组,ZFP组细胞培养上清液中HBV DNA 拷贝量和HBeAg 含量分别下降了51.7%（t=23.079,P=0.000,９５％CI=44.98%～58.52%）、33.8%（t=3.887,P=0.003,９５％CI=12.12%～55.48%）;细胞内HBV mRNA也明显减少（t=3.616,P=0.022）。结论：人工设计的可特异性结合于HBX的ZFP可于HepG2.2.15细胞中有效抑制HBV转录。     

YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）对乙型肝炎病毒（HBV）蛋白表达和抗原分泌的影响。方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒。在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过Western印迹检测YTHDF1对HBV蛋白表达的影响。在HepG2.2.15细胞中过表达和敲降YTHDF1, 在Huh7细胞中同时过表达pHBV1.3质粒,通过ELISA检测YTHDF1对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。结果:与正常肝细胞相比,YTHDF1在肝癌细胞Huh7（t=17.4）、HepG2.2.15细胞中（t=39.6）高表达。成功构建过表达和敲降YTHDF1质粒并验证其有效。敲降YTHDF1抑制HBV基因组编码的HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）表达,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。过表达YTHDF1促进HBsAg（Huh7细胞t48 h=5.5,t72 h=5.0;HepG2.2.15细胞 t48 h=5.3,t72 h=27.4）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=5.7,t72 h=6.3;HepG2.2.15细胞t48 h=29.0,t72 h=6.6）的分泌,而敲降YTHDF1抑制HBsAg（Huh7细胞t48 h=16.0,t72 h=7.9;HepG2.2.15细胞t48 h=22.3,t72 h=7.0）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=9.0,t72 h=14.3;HepG2.2.15细胞t48 h=8.1,t72 h=6.6）的分泌（均P＜0.05）。结论:YTHDF1可能具有增加HBV蛋白表达及促进HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用。     

全蝎和蜈蚣的多肽粗提物对肝癌HepAD38细胞中HBV的抑制作用

目的: 研究全蝎尾部多肽粗提物（peptide extract from scorpion tail,PEST）与蜈蚣头部多肽粗提物（peptide extract from centipede head, PECH）对肝癌细胞乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）合成的影响及其可能机制。方法：超滤法提取PEST与PECH。选取肝癌HepAD38和HepG2细胞,将其分组：对照组,用含10%胎牛血清的培养基培养;PEST组,不同浓度PEST（0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL）处理;PECH组,不同浓度PECH（0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL）处理;阳性对照组,拉米夫定或恩替卡韦或四环素处理。MTT法检测细胞活力,qRT PCR检测HepAD38细胞上清液HBV DNA含量。另取HepAD38细胞,分为PEST组（1 mg/mL PEST处理）、PECH组（1 mg/mL PECH处理）、对照组、阳性对照组和阴性对照组;ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg含量,qRT PCR检测HBV X、S、preC、P mRNA表达量,蛋白印迹法检测HBV核心蛋白（HBV core protein,HBc）表达。结果：PEST或PECH处理的肝癌细胞HepG2和HepAD38细胞活力均在70%以上;与对照组相比,PEST组（0.250、0.500和1.000 mg/mL）和PECH组（0.125、0.500和1.000 mg/mL）HBV DNA拷贝数明显降低（P均<0.05）;与对照组相比,PEST组和PECH组HBsAg和HBeAg含量明显降低（P均<0.05）,HBV P mRNA相对表达明显降低（P均<0.05）,PEST组HBc表达几乎无差异,而PECH组HBc表达减少。结论：PEST和PECH在HepAD38细胞株中表现出抗HBV作用,可能与其抑制HBV P mRNA合成有关。     

顺铂通过CREB1诱导乙肝病毒再激活的实验研究

目的：探索顺铂诱导乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）再激活的机制。方法：将稳定表达HBV的肝癌细胞系Hep－AD38分为2组,即磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）对照组及顺铂（Cisplatin）处理组,分别检测cAMP应答元件结合蛋白质-1（cAMP responsive element binding protein 1,CREB1）、乙肝病毒蛋白表达（HBsAg、HBcAg）及病毒复制水平（HBV DNA、HBV mRNA）;同样在成功构建稳定敲低CREB1（shCREB1）的HepAD38细胞中,同正常表达HBV的肝癌细胞系Hep－AD38进行对照,检测经顺铂处理后的HBV复制水平（HBV DNA、HBV mRNA）及蛋白表达水平（HBsAg、HBcAg）。结果：稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38中,Western blot检测显示,与PBS对照组相比,Cisplatin处理组中CREB1相对表达量为1.355±0.049（P=0.010）;HBsAg蛋白相对表达量为1.679±0.060（P=0.003）;HBcAg蛋白相对表达量为1.488±0.047（P=0.005）。qRT-PCR结果显示经顺铂处理后,HBV DNA绝对表达量为249.600±54.400（P=0.006）;HBV mRNA相对表达量为3.084±0.256（P=0.000）;以上结果表明在HepAD38细胞中乙肝病毒蛋白表达水平以及病毒复制水平较PBS对照组明显上调,均具有统计学差异;与此同时,选择转入shCREB1质粒的HepAD38细胞,即shCREB1细胞,以及转入对照质粒且能正常表达CREB1的Hep－AD38细胞,即shControl细胞,2种细胞组内均设置PBS对照组和Cisplatin处理组,分别检测乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制水平。qRT-PCR结果显示,HBV DNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为518.300±3.458;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为265.300±3.125（P=0.000）;HBV mRNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为2.713±0.318;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为1.263±0.056（P=0.000）。Western blot分析显示shControl细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.254±0.001、2.238±0.041;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.121±0.036（P=0.021）、1.681±0.015（P=0.000）。结论：顺铂可以通过CREB1促进乙肝病毒复制水平以及蛋白表达水平上调。     

HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

目的：构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）标签的乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X pro－tein,HBx）特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定。方法：将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA 亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果。结果：酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达（P=0.01）。结论：成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础。     

顺铂通过ROS促进乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的：探索顺铂（cisplatin）促进乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的分子机制。方法：采用不同浓度的顺铂处理稳定表达HBV的HepAD38细胞,台盼蓝染色检测细胞活力,筛选出顺铂最适浓度,分别采用Real-time PCR和Southern blot检测HBV DNA水平,Western blot检测HBsAg和HBcAg蛋白表达。在顺铂诱导组加或者不加氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）,采用CellROX Orange Reagent染料在激光共聚焦显微镜下检测细胞内ROS水平,并且检测HBV DNA 水平、HBsAg及HBcAg的蛋白水平。结果：台盼蓝染色筛选出顺铂的最适浓度为6 μmol/L。Real-time PCR实验结果显示,PBS组,0.5、2.0、6.0 μmol/L顺铂处理后HBV DNA 拷贝数/细胞分别为515.152±18.924、1 215.758±49.001（P=0.000）、1 678.182±117.223（P=0.000）、2 110.606±143.640（P=0.000）;Southern blot结果与Real-time PCR结果一致,顺铂以剂量依赖方式增加HBV DNA水平。Western blot结果表明,与PBS组相比,6.0 μmol/L顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.102±0.099（P=0.000）、4.001±0.200（P=0.000）;顺铂可以促进HBV复制和病毒蛋白的表达。进一步采用NAC与顺铂联合处理HepAD38细胞,Real-time PCR实验结果表明,顺铂组、顺铂+NAC组HBV DNA 拷贝数/细胞分别为2 180.444±82.573（P=0.000）、1 041.778±50.918（P=0.000）,2组差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.139±0.061（P=0.000）、3.812±0.109（P=0.000）,顺铂+NAC组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为2.101±0.088（P=0.000）、1.613±0.073（P=0.000）,2组之间HBsAg、HBcAg蛋白差异均具有统计学意义。结论：顺铂通过增强细胞内ROS水平,促进HBV复制,而NAC可以部分抑制顺铂刺激的HBV复制作用。     

HBx通过Wnt/β-catenin通路促进HepG2细胞增殖

目的 探讨Wnt/β-catenin通路在稳定表达乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)的HepG2肝癌细胞增殖中的作用机制. 方法 验证前期构建的HepG2/HBx细胞株能稳定表达HBx蛋白.CCK 8法检测HepG2/HBx,HepG2/mock及HepG2 3组细胞增殖情况,RT-PCR及Western-blot法分别检测上述3种细胞中β-cateninmRNA和蛋白表达水平;最后检测β-catenin选择性抑制剂XAV939(20 μmol/L)对各组细胞增殖水平的影响. 结果 前期构建的HepG2/HBx细胞株能稳定表达HBx蛋白.细胞增殖实验表明,HepG2/HBx组细胞增殖能力强于对照组(P＜0.05).RT-PCR及Western-blot检测结果显示,HepG2/HBx组细胞中β-catenin的mRNA及蛋白表达水平均高于对照组(P＜0.05),而HepG2/mock及HepG2组细胞之问则无明显差别.XAV939能够抑制各组细胞的增殖能力,HepG2/HBx组细胞在加入20 μmol/L XAV939作用后的增殖速度较加入相同浓度DMSO的HepG2/HBx组细胞下降(P＜0.05).XAV939对HepG2/HBx组细胞增殖的抑制强于对照组. 结论 HBx蛋白可以上调肝细胞β-catenin表达,激活Wnt邝-eatenin通路,促进肝癌细胞增殖.选择性β-catenin抑制剂可部分逆转该作用.     

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.     

siRNA沉默HBx基因对肝癌细胞YKL-40蛋白表达影响的研究

目的 观察HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒X(HBx)基因沉默对酿酒酵母YKL-40蛋白表达的影响.方法 构建靶向HBx基因的siRNA真核表达载体pRNAT-HBx和阴性对照质粒,同时设空白对照组,采用Lipofectinamine 2000脂质体转染法转染人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞.采用RT-PCR检测各组中HBx和YKL-40的mRNA水平,Western blot、细胞免疫荧光检测各组中HBx蛋白和YKL-40蛋白的表达.结果 pRNAT-HBx明显抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,同时YKL-40的mRNA和细胞内蛋白表达水平也随之相应下调.结论 抑制HBx基因的表达能下调HepG2.2.15细胞中YKL-40蛋白的表达,提示HBx蛋白对YKL-40蛋白的表达具有一定的激活作用.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。