乙型肝炎病毒X蛋白截短突变体的构建及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响

 目的：观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）截短突变体在细胞内的定位及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。方法：采用PCR克隆全长野生型HBx基因,在此基础上,分别构建融合增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因和缺失HBx基因C端49~154 aa、C端85~154 aa、N端1~57 aa + C端141~154 aa、N端1~57 aa或N端1~84 aa截短突变体的表达载体;激光共聚焦显微镜下观察HBx截短突变体在HEK293细胞中的定位;采用萤光素酶报告系统检测HBx截短突变体对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。结果：（1）成功构建了HBx截短突变体与EGFP基因融合的表达载体。（2）野生型HBx及截短突变体在HEK293细胞中具有不同的定位,其中N端缺失突变体主要定位于细胞核周胞质;C端缺失突变体在胞质胞核中呈均匀分布;N端+C端缺失突变体的定位类似于野生型HBx,主要定位于胞质,呈不均一的粗大颗粒,胞核中也有少量表达。（3）与野生型HBx相比,HBx C端49~154 aa、C端85~154 aa、N端1~57 aa + C端141~154 aa、N端1~57 aa和N端1~84 aa缺失突变体在Huh7细胞中均使Wnt/β-catenin信号通路的转录活性明显下降,分别下降了78.7%、84.7%、75.7%、93.8%和95.5%。结论：HBx不同截短突变体的细胞定位及对Wnt/β-catenin信号通路转录活性不同,提示HBx的不同功能区对Wnt信号的转录激活发挥着不同的作用。     

乙型肝炎病毒复制对肝癌细胞Arid2基因表达的影响

目的:初步研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染及其复制对肝癌细胞中抑癌基因Arid2(AT-rich interactive domain 2)表达的影响。方法:采用携带HBV基因组1.1倍体的复制型重组腺病毒Ad-HBV1.1感染Huh7细胞,或者四环素诱导的HBV复制细胞模型Hep AD38细胞,观察HBV瞬时或稳定复制细胞模型中Arid2的表达变化;进一步采用HBV各元件乙型肝炎病毒S蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBV-pol)、乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的过表达质粒转染Huh7细胞,明确病毒自身编码蛋白对Arid2表达的调控作用。在上述细胞模型中,运用Southern-blot、ELISA、real-time PCR的方法验证HBV的感染与复制情况,通过RT-PCR、Western blot检测肝癌细胞抑癌基因Arid2表达水平的变化。结果:HBV瞬时转染或稳定复制细胞模型中,Ad-HBV1.1感染的Huh7细胞m RNA和蛋白表达水平明显降低,Western blot结果显示Arid2蛋白表达水平降低了46.10%(P<0.05);在HBV稳定复制的Hep AD38细胞中,Arid2蛋白表达水平降低了37.63%(P<0.05)。转染HBV 4种病毒编码蛋白过表达质粒的Huh7细胞中,过表达HBs、HBx组较其他实验组Arid2表达水平明显降低,Western blot结果显示Arid2蛋白表达水平在HBs组降低了54.55%(P<0.05),在HBx组降低了46.38%(P<0.05)。结论:HBV的感染和复制导致肝癌细胞中Arid2的表达水平下调,Arid2基因的表达与HBV复制水平呈负相关,其中HBs、HBx对Arid2的下调作用较明显。     

siArid2重组腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

 目的:通过RNA干扰技术沉默内源性抑癌基因Arid2(siArid2)的表达,观察其对肝癌细胞生长及细胞周期的影响。方法: 设计3对特异性沉默Arid2基因的shRNA序列,分别克隆到腺病毒骨架载体上形成重组腺病毒质粒。将质粒转染到HEK293细胞中,包装和扩增形成完整高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。用构建好的腺病毒感染人肝癌SMMC-7721细胞,Western blotting方法检测Arid2蛋白的表达,筛选干扰效果最佳的重组腺病毒。MTS技术和流式细胞术观察干扰Arid2基因后肝癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果: 成功构建了高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。经Western blotting鉴定,AdsiArid2-3为抑制效果最佳的重组腺病毒。MTS结果显示,AdsiArid2组细胞在72 h、96 h的吸光度值与空细胞组和Adsicontrol组相比增高,细胞增殖速率明显加快。流式细胞术检测结果显示,AdsiArid2组处于G1期、S期的细胞百分比与空细胞组和Adsicontrol组相比,G1期细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多。结论: 成功构建干扰Arid2的重组质粒及重组腺病毒。沉默Arid2可以促进肝癌细胞的增殖,促进其由G1期向S期的转换。