质粒单独转染与共转染哺乳动物培养细胞的对比研究

我们对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞通过鳞酸钙围染技术，用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因ｎｅｏ’基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ进行了共转染，用含ＨＣＶＣ，Ｅ１，Ｅ２以及ｎｅｏ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＥ２进行了单独转染，经Ｇ４１８筛选，分别获得了Ｇ４１８抗性细胞；Ｐ８１５－Ｓ和Ｐ８１５－ＣＥ２细胞，提示单独转染与共转染的获成功，进一步证实的质粒单独转染与共转染哺乳支     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

IL—12提高DNA疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤的免疫研究

目的 观察ＩＬ－２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果 对照组、ｐＣＲ３．１－Ｓ及共同免疫     

乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP

目的 建立用真核细胞报告基因ＳＥＡＰ转染人肝癌细胞系及鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）的表达系统,供研究ＨＢＶ基因功能应用。方法 分别将带有分泌性碱性磷酸酶（ＳＥＡＰ）报告基因的ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ及ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ转染Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及ＬＭＨ细胞,并用ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ与Ｓ基因区变异体的克隆ＨＢＶ ＤＮＡ共转染ＨｅｐＧ２细胞。培养后收取细胞培养液,用ＥＬ     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

选择P815作为DBA/2小鼠H─2抗原靶细胞

采用ＤＢＡ／２和Ｃ５７ＢＬ／６二组主要组织相容性复合体不相同的近交系小鼠，将ＤＢＡ／２小鼠的淋巴细胞植入Ｃ５７ＢＬ／６体内，分别选用Ｐ８１５和Ｄ８Ａ／２小鼠的淋巴细胞作为靶细胞，应用抗体－补体介导细胞杀伤的免疫学方法，研究Ｐ８１５作为ＤＢＡ／２小鼠Ｈ－２抗原靶细胞的可行性，实验结果显示，Ｐ８１５可以替代ＤＢＡ／２小鼠的淋巴细胞作为靶细胞。     

插入增子后人β—珠蛋白基因在MEL细胞中的表达

将人β－珠蛋白基因（２．４ｋｂ），分别反向克隆入逆转录病毒载体Ｎ２β和Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ３′ＬＴＲ插入４１２ｂｐ的增强子ＨＳＩＩ（简称Ｎ２ＡβＥ０．４）。将此两种逆转录病毒重组质粒分别转入φ－２和ＰＡ３１６细胞，经Ｇ４１８筛选后，用ＰＡ３１７细胞产生的病毒粒子感染小鼠红白血病细胞ＭＥＬ。结果显示，人β－珠蛋白基因可在ＭＥＬ内得到表达，来自人ＨＳＩＩ（４１２ｂｐ）的增强子可以增强人β－珠蛋白基因ｍＲ     

人源性抗EB病毒IgG/VCA抗体在SCID小鼠中的诱导

将人外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）和腹腔淋巴结淋巴细胞（ＰＬＮＬ）移植入严重联合免疫缺陷疾病（ＳＣＩＤ）小鼠腹腔，２个月后，小鼠血清内产生人源性ＩｇＧ和抗ＥＢ病毒壳抗原ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ／ＶＣＡ）。比较结果显示，用Ｂ９５－８细胞作为ＶＣＡ来源所诱导的实验组１０只小鼠，ＩｇＧ／ＶＣＡ阳性率为７０％（７／１０），对照组为１７％（２／１２）。ＩｇＧ／ＶＣＡ的几何平均滴度（ＧＭＴ）和血清ＩｇＧ浓度，在１４只ＳＣＩＤ－ＰＬＮＬ小鼠中为１∶１０８和（９６．２±５６．４）μｇ／Ｌ；在８只ＳＣＩＤ－ＰＢＬ小鼠为１∶７．８和（１３．８４±６．０）μｇ／Ｌ。该结果提示，ＳＣＩＤ－ＰＬＮＬ小鼠较ＳＣＩＤ－ＰＢＬ小鼠更适合用于人源性特异ＩｇＧ的诱导。     

活化B淋巴细胞与NS1瘤细胞融合瘤苗的抗肿瘤免疫治疗

观察活化Ｂ淋巴细胞与ＮＳ１骨髓瘤细胞融合瘤苗对荷ＮＳ１瘤ＢＡＢＬ／Ｃ小鼠免疫治疗作用。方法用灭活ＮＳ１瘤细胞及其裂解物免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠活化的Ｂ淋巴细胞；以５０％ＰＥＧ为融合剂，将免疫脾Ｂ淋巴细胞与野生型ＮＳ１骨髓瘤细胞融合，经ＨＡＴ选择性培养，筛选融合细胞，     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达

以ｐＲＣ／ＣＭＶ作为真核细胞表达性载体，用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＸｂａⅠ将ＨＧＦｃＤＮＡ全序列定向重组到ｐＲＣ／ＣＭＶ的多克隆位点上。筛选得到的重组质粒以磷酸钙ＤＮＡ共沉淀的方法转染ＣＨＯ细胞，经８００ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８筛选，获得阳性细胞克隆。用ＨＣＣ－７９０２细胞及原代培养的成年大鼠肝细胞对转染阳性细胞培养基收集上清进行活性测定。３Ｈ－ＴｄＲ掺入等分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可明显刺激鼠肝细胞ＤＮＡ的合成。结果表明，重组人ＨＧＦ基因在ＣＨＯ细胞中成功地获得表达，为基因工程大量制备和纯化ＨＧＦ奠定了基础     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901／V …

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体，经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，并检测ｂａｘ基因在转导株的表达。方法 采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ｃｍｖ的多克隆位点之间，以脂质体倡导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ，将之转入细胞后，经Ｇ４１８筛选３０ｄ     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

插入增强子后人β－珠蛋白基因在MEL细胞中的表达

将人β－珠蛋白基因（２．４ｋｂ），分别反向克隆入逆转录病毒载体Ｎ_２β和Ｎ_２Ａ，并在Ｎ_２Ａ３＇ＬＴＲ插入４１２ｂｐ的增强子ＨＳⅡ（简称Ｎ_２ＡβＥ０．４）。将此两种逆转录病毒重组质粒分别转入（－２和ＰＡ３１７细胞，经Ｇ４１８筛选后，用ＰＡ３１７细胞产生的病毒粒子感染小鼠红白血病细胞ＭＥＬ。结果显示，人β－珠蛋白基因可在ＭＥＬ内得到表达，来自人ＨＳⅡ（４１２ｂｐ）的增强子可以增强人β－珠蛋白基因ｍＲＮＡ的表达水平。     

谷胱甘肽巯基转移酶pi参与肿瘤细胞耐药性的产生

目的建立携带大鼠谷胱甘肽巯基转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）ＣＤＮＡ的细胞表达体系。方法用磷酸钙沉淀法将重组质粒ｐＳＶ－ＧＴ和载体质粒ｐＳＶ－ｎｅｏ分别转染ＨｅＬａ细胞,Ｇ４１８筛选得两株转染阳性细胞ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ和ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ;采用细胞原位杂交法,以地高辛标记的ＧＳＴ－ｐｉ　ｃＤＮＡ为探针,检测两细胞株ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的表达水平;用ＭＴＴ法检测不同抗癌药物对细胞株的毒性作用。结果ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ表达明显升高,而ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ和ＨｅＬａ细胞的表达水平很低。阿霉素、丝裂霉素Ｃ和顺铂对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＩＣ５０分别为７０．１３、１０．９５和１６．５２ｕｇ／ｍｌ,对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ的ＩＣ５０分别为１０．３４、７．４８和１３．７０ｕｇ／ｍｌ,长春新碱对两细胞株的毒性无明显差别。结论ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ细胞具有较高的耐药性。ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的大量表达可能是产生多药耐药的原因,此细胞株可作为一个稳定的遗传学系统在ＧＳＴ－ｐｉ与肿瘤细胞耐药的研究中广泛应用。     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再