靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。     

靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的 针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响.方法 将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数.RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30％和85.00％(P＜0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80％和48.90％,对HBV DNA抑制率分别为76.56％和66.41％(P＜0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25％、43.48％(P＜0.01).而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用.结论 靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础.     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒转录与复制的实验研究

目的观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)对乙型肝炎病毒(HBV)基因转录和病毒复制的影响。方法将不同剂量的HCVcore表达质粒(pNKF-HC Vcore)转染HepG2.2.15细胞。以空载质粒(pNKF)转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照,转染HepG2细胞作为阴性对照。以Northern吸印杂交检测HBV mRNA的转录水平,以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA的复制水平。结果20μg pNKF-HCV core转染HepG2.2.15细胞后,可使细胞中HBV mRNA转录水平及HBV复制中间体DNA复制水平明显降低,抑制率分别为51.9%及36.5%。10μg及15μg pNKF-HCV core较pNKF转染的HepG2.2.15细胞的HBV mRNA信号与HBV复制中间体DNA检出信号强度无显著差异。结论HCV核心蛋白达到一定的剂量后能够在一定程度上抑制HBV的转录与复制。     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的 研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性.方法 将pcDNA3.1-MXA重组质粒和PU19-1.24 HBV重组质粒分别按1:1、2:1共转染HepG2细胞(MXA组),对照组使用空pcDNA3.1、Salon DNA和PU19-1.24 HBV重组质粒共转染,3 d后Western blot检测MXA蛋白表达,Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量,定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平,统计学分析结果 .pcDNA3.1-MXA与PU19-1.24HBV重组质粒共转染HepG2细胞,对照组为pcDNA3.1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染,3 d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达.结果 Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达;与对照组相比,pcDNA3.1-MXA和PU19-1.24 HBV重组质粒按1:1转染时,MXA组HBeAg下降27%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0.6个log值;按2:1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1.9个和1.7个log值,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别.结论 MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性,抑制活性与蛋白的表达量相关;在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解.     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。     

tRNAval-shRNA表达框在筛选HBV C基因小干扰RNA靶位中的应用

目的：以tRNA^val-shRNA表达框技术筛选高效的HBV C基因siRNA靶位。方法：针对HBV C基因序列设定5个siRNA靶位，以一步重叠延伸PCR技术生成含tRNA^val启动子的shRNA表达框（SEC），分别与HBV C基因与EGFP融合表达质粒（pC-EGFP）共转染AD293细胞，转染后48h，流式细胞术检测融合基因荧光表达情况，半定量RT-PCR法检测HBV-C基因mRNA表达水平。以筛选的shRNA表达框转染hepG2．2．15细胞，72h后放免法检测细胞培养上清HbsAg、HbeAg水平，RT-PCR检测细胞HBV pgRNA水平。结果：共转染shRNA表达框能有效抑制融合表达质粒（pC-GFP）荧光强度和HBV C mRNA表达，其中SEC-492i抑制效率最佳，而SEC-282i相对较差。选定的492i表达框（SEC-492i）及282ishRNA表达框（SEC-282i），均呈剂量依赖性抑制hepG2．2．15细胞HbeAg分泌和HBV pgRNA水平，其中SEC-492i抑制HbeAg和HBV pgRNA水平明显优于SEC-282i。结论：在选定的5个siRNA靶位中，以492i靶位RNAi效率最高。tRNA^val-shRNA表达框技术可用于抗HBV高效siRNA靶位的筛选，有进一步推广应用价值。     

载体介导的RNAi抑制乙肝病毒S基因的研究

目的构建针对乙肝病毒S基因的RNAi表达载体,观察其对HBV表达的影响。方法合成针对HBVS基因的RNAi寡核苷酸,克隆入pSUPER载体,与pHBV质粒共转染HepG2细胞。ELISA和Westernblot检测HBsAg表达。结果成功构建针对HBVS基因的RNAi表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2对HBsAg的抑制率分别为79.0%和43.2%,无关序列的RNAi表达载体无此作用。结论载体介导的RNAi能高效、特异地抑制HBVS基因的表达。     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

表达A3C的HBV载体质粒抑制HBV的研究

目的 观察表达人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)的复制缺损型HBV载体质粒抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达A3C和人绿色荧光蛋白(hrGFP)的FIBV载体质粒pcH-LJ3-A3C、pCH-LJ3-hrGFP.分别与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot检测;提取细胞裂解液中核心蛋白相关的HBV DNA,PCR扩增,克隆,测序.结果 pCH-LJ3-A3C对细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA具有抑制作用,使细胞浆内HBV DNA减少31%,使上清液中子代病毒颗粒HBV DNA减少40%;对HBV DNA具有编辑作用,50个克隆测定HBV DNA序列,36克隆出现G-A突变,G-A突变总数量982位点.结论 pCH-LJ3-A3C可以抑制HBV复制,pCH-LJ3-A3C对HBV DNA的编辑作用是其发挥作用的主要原因,pCH-LJ3-A3C可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗HBV感染.

Abstract：

Objective To observe the inhibitory effect of a replication-defective hepatitis B virus (HBV) vector plasmid expressing A3C on HBV replication in vitro. Methods The HBV vector plasmisd pCH-LJ3-A3C and pCH-LJ3-hrGFP expressing A3C and hrGFP were constructed using PCR and gene recombination technique. The two recombinant plasmids were separately cotranfected into HepG2 cells along with the wild-type HBV plasmid pCH-3093. The HBV DNA in the cell cytoplasmic lysates and in the cell culture supernatant was extracted for Southern blotting, and the nucleocapsid-associated HBV DNA were amplified by PCR, cloned and sequenced. Results pCH-LJ3-A3C showed obvious inhibitory effect on HBV DNA in the cytoplasmic lysates and cell culture supernatant, causing a reduction of the HBV DNA by 31% and 40%, respectively. The pCH-LJ3-A3C plasmid was capable of editing the HBV DNA. Among the 50 sequenced clones, 36 clones had G-A mutations, with a total of 982 such mutations. Conclusion pCH-LJ3-A3C can inhibit the replication of HBV primarily by editing HBV DNA. The pCH-LJ3-A3C plasmid may serve as a new antiviral agent against human HBV infection.     

应用腺病毒载体系统将HBV/C全基因组转导入HepG2细胞的方法学研究

目的 运用腺病毒系统将HBV/C全基因组高效地导入肝癌细胞系,为研究HBV的复制及蛋白表达情况构建技术平台.方法 构建HBV/C基冈型毒株的1.3拷贝全基因序列,运用腺病毒系统(AdEasy),首先将1.3拷贝HBV全基因序列插入到穿梭载体pAdTrack,经测序证实插入序列的正确性后用Pme I酶切线性化重组穿梭质粒,转化Adeasier-I感受态细胞,在细菌细胞内发生同源重组,所得重组腺病毒质粒pAdEasy-HBV/C用PacI酶切线性化,用脂质体法转染293细胞来包装重组病毒.用适量感染复数的重组腺病毒感染HepG2细胞,并对感染细胞上清中的HBV DNA、HBeAg和HBsAg分别进行了定量检测.结果 成功运用腺病毒系统将1.3拷贝HBV全基因组高效率地导入HepG2细胞,导入的HBV能够运用自身的复制调控元件进行病毒的复制和蛋白表达.结论 运用AdEasy系统能够简便、快速、高效地将HBV全基因组导入肝癌细胞系,为抗病毒药物的筛选及评价提供了有效的技术平台.     

Ad-1.2乙型肝炎病毒感染HepG2细胞后HBV cccDNA的动态分析

目的 研究Ad-1.2 HBV感染HepG2细胞后HBV的复制情况.方法 携带1.2拷贝FIBV DNA的腺病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2,ELISA法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达;利用质粒抽提试剂盒提取细胞内cccDNA,经绿豆核酸酶处理后,用特异引物进行实时定量PCR检测.结果 Ad-1.2HBV感染HepG2细胞后,可有效表达HBsAg及HBeAg;感染后第1天即可在细胞内检出cccDNA,第4天达到高峰.结论 Ad-1.2HBV感染细胞,可作为抗病毒药物筛选和评价的模型.