MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性。方法将pcDNA3．1-MXA重组质粒和PU19-1．24HBV重组质粒分别按1：1、2：1共转染HepG2细胞（MXA组），对照组使用空pcDNA3．1、Salon DNA和PU19-1．24HBV重组质粒共转染，3d后Western blot检测MXA蛋白表达，Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量，定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平，统计学分析结果。pcDNA3．1-MXA与PU19-1．24HBV重组质粒共转染HepG2细胞，对照组为pcDNA3．1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染．3d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达。结果Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达：与对照组相比，pcDNA3．1-MXA和PU19—1．24HBV重组质粒按1：1转染时，MXA组HBeAg下降27％．上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0．6个log值；按2：1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66％，上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1．9个和1．7个log值，差异均具有统计学意义（P〈0．05）。Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别。结论MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性，抑制活性与蛋白的表达量相关；在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解。     

肠致病性大肠杆菌的生物膜形成对致病岛基因的影响

目的研究不同p H值条件对肠致病性大肠埃希菌生物膜形成能力及对致病岛基因的影响。方法将2株EPEC菌株(E11313和E11435)分别接种于p H值为7、9和11的LB培养基,用结晶紫染色半定量法检测2株菌株产生物膜能力,观察产生物膜菌株及非产生物膜菌株生物膜形成的差异,将2株菌株产生的生物膜溶解,提取总RNA,定量PCR检测不同p H浓度的生物膜与致病岛基因Esp A表达水平的关系。结果 E11435为生物膜阳性菌株,E11313为生物膜阴性菌株,p H为7~9之间,生物膜的形成变化不大,当p H值=11时,菌株形成生物膜更容易,E11435菌株形成的生物膜可影响EPEC致病岛Esp A基因的表达,且当p H=11时,Esp A表达水平明显提高(P<0.05)。结论碱性环境可促进肠致病性大肠杆菌生物膜的形成。生物膜阳性肠致病性大肠杆菌可显著提高致病岛Esp A基因的表达水平。     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105cuf/ml。结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。     

屎肠球菌临床分离株生物膜形成与毒力基因及ST分型之间的关系

目的 研究临床分离屎肠球菌株生物膜形成与ST分型和毒力基因之间的关系。方法 收集深圳市南山医院2011—2017年临床分离的不重复屎肠球菌共122株,采用结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力,对分离株进行多位点序列分型(MLST)分析, PCR方法检测屎肠球菌临床株毒力基因表面蛋白(esp )、透明质酸酶(hyl )、表面聚集蛋白(asa1 )、明胶酶(gelE )、溶细胞素(cylA )等的分布。结果 122株屎肠球菌生物膜形成阳性率为49.2%,其生物膜形成能力主要表现为弱阳性。屎肠球菌毒力基因检测提示esp 和hyl 检出率分别为39.3%(48/122)和15.6%(19/122),所有菌株未检测到asa1 、gelE 、cylA ;其中esp 阳性与生物膜形成能力相关(P <0.05),而hyl 阳性与生物膜形成能力无相关性(P >0.05)。MLST分型提示屎肠球菌临床株主要为ST78及ST18型,分别为26株及18株,其中ST78与ST18之间生物膜形成能力差异无统计学意义(P >0.05),esp 更常见于ST78分离株。结论 临床分离屎肠球菌生物膜形成能力较弱,其毒力基因esp 阳性更容易形成生物膜,而hyl 与生物膜形成能力无明显相关性,ST78与ST18之间生物膜形成能力无明显差异,esp 更常见于ST78分离株。     

双歧杆菌肠道内调控表达肠道病毒71型VP1蛋白的实验研究

目的构建重组肠道病毒71VP1基因双歧杆菌,制成口服疫苗,用于EV71感染预防。方法扩增EV71病毒VP1基因并将其插入到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBBAD/Xs中,构建VP1表达载体(pBBADs-VP1),通过Western blot检测VP1蛋白在pBBADs-VP1转化菌中的表达。选取BALB/c小鼠,分为B-VP1组、VP1组、GFP组和生理盐水组,B-VP1组口服pBBADs-VP1-转化双岐杆菌,VP1组腹腔注射大肠埃希菌表达纯化的重组VP1蛋白,GFP组口服pBBADs-GFP转化双岐杆菌,生理盐水组口服生理盐水,观察pBBADs-VP1-转化双岐杆菌口服免疫对EV71感染的免疫反应:包括病毒的中和抗体滴度、抗EV71-VP1抗体以及诱导脾脏和淋巴集结中Th1免疫反应。结果与GFP组及生理盐水组比较,B-VP1组及VP1组中和抗体滴度及抗EV71-VP1抗体水平,均显著增加;口服表达VP1蛋白长双歧杆菌和注射VP1蛋白都会诱导Th1细胞因子免疫反应(P<0.05),表达VP1蛋白长双歧杆菌较易诱导局部肠道的Th1模式,而注射VP1蛋白较易诱导全身性免疫。攻毒试验显示,VPI和B-VP1组新生鼠攻击后第15d(剂量1 000LD50)存活率分别为20.00%和16.67%,对照组无小鼠存活。结论利用长双歧杆菌表达VP1蛋白的口服疫苗可能成功激发针对EV71病毒感染的特异性免疫应答。用表达VP1的重组双歧杆菌免疫母鼠,可以赋予新生小鼠以保护。     

K83A变异MxA蛋白抑制HBV复制体外研究

目的研究K83A变异MxA蛋白抑制HBV复制活性。方法将pcDNA3.1-MxA(wild-type)重组质粒(WT组)、pcDNA3.1-MxA-K83A重组质粒(K83A组)和pcDNA3.1空质粒(对照组)分别与pU19-1.24HBV重组质粒按2∶1比例瞬时共转染HepG2细胞,转染3d后western blot检测MxA蛋白表达,Abbott检测各组细胞上清HBsAg和HBeAg表达,定量PCR检测上清和细胞内HBV DNA水平,统计学分析结果。结果MxA、K83A组有较好的MxA蛋白表达;与对照组相比,K83A组和MxA组上清HBeAg分别下降73%和71%(P<0.05),上清HBV DNA水平分别下降2.22lg和2.11lg(P<0.01),细胞内HBV DNA水平下降1.89lg和1.78lg(P<0.01)。结论K83A变异不影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。     

小鼠日本血吸虫病肝纤维化肝脏CTGF的表达及意义

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏中的表达状况及意义。方法用昆明小鼠感染尾蚴复制小鼠日本血吸虫病肝纤维化模型;RT-PCR和免疫组化分别检测小鼠肝脏CTGFmRNA和蛋白的表达,免疫组化方法观察各阶段肝脏α-SMA阳性细胞的表达。结果模型组10周时形成典型的肝纤维化,此时模型组小鼠肝脏CTGFmRNA和蛋白表达、α-SMA 细胞数达高峰,10周、14周、18周时与治疗组相比均有明显的统计学差异(P均>0.05);CTGFmRNA和蛋白表达水平与α-SMA 细胞数均呈直线相关性。结论CTGF基因和蛋白表达增高与小鼠日本血吸虫病肝纤维化形成有密切关系;CTGF在小鼠日本血吸虫病肝纤维化形成过程中的作用可能主要通过作用于活化的肝星状细胞来实现的。     

慢性重型乙型肝炎患者隐孢子虫感染的研究

目的探讨慢性重型肝炎与隐孢子虫感染的关系，为防治该病提供依据。方法用金胺-酚染色法(AA—P)和改良抗酸染色法(MAF)检测218例慢性重型乙型肝炎(慢重肝)患者和140例腹泻儿童粪便标本隐孢子虫卵囊，用PCR技术检测其DNA，并进行内切酶分析；对隐孢子虫感染影响因素进行分析。结果经AA-p、MAF和PCR检测，慢重肝患者隐孢子虫感染率分别为4．1％、3．2％和6．0％；腹泻儿童感染率为0．7％、0．7％和1．4％、PCR结果显示，慢重肝患者隐孢子虫感染率高于腹泻儿童；阳性患者腹泻史、动物接触史明显高于阴性患者，农村患者感染率高于城市患者结论慢性重型肝炎患者对隐孢子虫的易感性增加，隐孢子虫感染是引起慢性重型肝炎患者腹泻和可能加重其病情的因素之一。     

甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌对喹红霉素敏感性分析及其分子分型特点

目的了解酮内酯类抗生素喹红霉素对临床分离甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的体外药物敏感性,以及MSSA不同分子分型型别与喹红霉素最低抑菌浓度(MIC)值的关系。方法收集深圳市南山医院2011—2015年不同临床标本分离的MSSA118株,用微量肉汤稀释法及K-B纸片法测定MSSA菌株对喹红霉素及其他9种临床常用抗金黄色葡萄球菌药物的MIC值。采用多位点序列分型(MLST)技术将其分为不同基因型,观察MSSA型别与喹红霉素对MSSA MIC值的关系。结果 MSSA对常用抗革兰阳性菌药物利奈唑胺、万古霉素、呋喃妥因、替考拉宁及阿莫西林/克拉维酸均敏感;对喹红霉素中介2株,耐药21株,耐药率19.5%,对红霉素耐药率则高达60.2%。该院MSSA分为32个ST型,20株属于新的ST型,前三的ST型分别为:ST7型15株(12.7%),ST188型12株(10.2%),ST59型12株(10.2%)。结论 MSSA对大环内酯类抗生素耐药形势严峻,喹红霉素较红霉素对MSSA更为强效。ST7、ST188、ST59和ST398是该院临床分离MSSA的主要MLST型别。     

靶向性血小板衍生生长因子siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 构建靶向性血小板衍生生长因子(PDGF)B链的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒,为进一步研究PDGF基因功能奠定基础.方法 根据PDGF-B链序列设计合成含靶向PDGF基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有Bam HI、HindIII酶切位点的pSilencer3.1-Hlhygro质粒连接,转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列.结果 PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实PDGF siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致.结论 成功构建了靶向性PDGF基因的siRNAs表达质粒. Abstract： Objective To construct the small interfering RNA (siRNA) expressing plasmids targeting platelet-derived growth factor(PDGF)and study the function of PDGF with RNA interference technology. Methods Two complementary 63-nt oligonucleotides targeting PDGF were synthesized with 5 single-stranded over-hangs according to the PDGF-B gene sequence in the Genebank and the kit manual,which were ligated with the linearized pSilencer3.1-Hlhygro.The plasmids were transformed into DH5α bacteria to amplify and then purified.The purified plasmids were identified by gel electrophoresis and sequencing.Results PDGF siRNA expression vectors were successfully constructed and identified by double endonuclease digestion.Sequence analysis of inserted fragment revealed the same sequence as synthesized siRNA oligonucleotides.Conclusions siRNA expression plasmids targeting PDGF have been successfully constructed.