EPB41基因突变导致遗传性椭圆形红细胞增多症一家系的分子诊断研究

  目的  对临床诊断为遗传性椭圆形红细胞增多症（HE）的一个家系进行遗传学病因分析。  方法  应用靶向捕获及高通量测序技术对先证者和家系中4名成员的外周血基因组DNA进行高通量测序,经过数据分析筛选可能的致病变异,同时使用生物信息学软件对变异进行功能预测,在家系中对检出的可疑致病性变异进行Sanger测序验证。同时对50例健康对照抽取外周血,进行正常人群突变位点检测。  结果  高通量测序结果显示临床表现为中度贫血的先证者和其母在EPB41基因第13外显子均存在杂合c.1215G>A（p.Trp405Ter）无义突变,为功能缺失型突变,有极强的致病性（very strong pathogenicity,PVS1）。该位点G碱基突变为A碱基,导致其编码的蛋白质链第405位的色氨酸的密码子变为终止密码子,使蛋白合成提前终止,形成截短蛋白,部分功能区域丧失。该变异在人群中极为罕见,为尚未报道的致病性突变。Sanger测序结果显示先证者外祖母亦携带这一杂合突变,且在此家系中观察到基因型和表型共分离。50例无亲缘关系的健康对照均未检测到突变。  结论  EPB41基因的c.1215G>A突变是本例HE家系的可疑致病原因。首次在中国HE家系中发现了EPB41基因致病性突变。     

CRYGD基因突变与一中国先天性核性白内障家系致病相关

目的对一先天性核性白内障家系进行候选致病基因的筛查,以明确其发病分子基础。方法以家系先证者基因组DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增10个白内障候选致病基因的突变热点区域,PCR产物纯化后进行直接DNA测序筛查突变位点。如发现疑似突变位点,则利用直接DNA测序法对该突变位点在家系其他成员的存在情况进行疾病表型与致病突变共分离分析,进一步确认其是否为致病性突变位点。结果该家系三代呈常染色体显性遗传,临床表型大致相同,可确诊为先天性核性白内障。候选致病基因筛查发现在患者的CRYGD基因外显子2发现一个杂合突变c.C70A,正常家系成员无此突变,临床表型与基因型共分离。该突变为错义突变,导致一个CRYGD蛋白第24位的脯氨酸被苏氨酸取代(p.P24T)。结论 CRYGD(p.P24T)突变是导致该先天性核性白内障家系的致病分子基础。     

X染色体连锁显性遗传先天性眼球震颤家系的致病基因突变研究

目的对4个X染色体连锁显性遗传先天性眼球震颤(XL-CIN)家系进行候选致病基因FRMD7突变筛查。方法采集家系成员外周血5 ml,提取基因组DNA;以4个家系的先证者基因组DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增FRMD7基因的全部外显子及其外显子-内含子拼接部的序列,DNA直接测序筛查突变位点;一旦发现突变致病性位点,则采用DNA双向测序方法在其他家系成员进行疾病与致病突变共分离分析,以及进一步确认突变,将患者的FRMD7基因外显子8和10的扩增产物克隆至TA克隆载体测序。结果 4个XL-CIN家系皆为X染色体连锁显性遗传伴外显不全,其中2个家系携带FRMD7基因已知致病性突变:XL-CIN 02家系存在c.G886C/GGT>CGT(p.G296R)错义突变,位于FRMD7基因外显子8;XL-CIN 03家系存在c.C910T/CGA>TGA(p.R304X)无义突变,位于外显子10。结论 FRMD7 G296R和R304X是导致XL-CIN 02和XL-CIN 03家系致病的主要原因。     

先天性白内障一家系的致病基因研究

目的 对一个来自浙江省杭州地区的三代先天性白内障家系进行常染色体显性遗传基因的突变分析,以寻找其可能的致病基因及突变位点。方法 该家系共10例成员,其中包括4例患者。10 例家系成员在浙江省人民医院眼科中心接受眼科专科检查及全身检查,以排除存在白内障以外的眼部及全身疾患。10例家系成员各抽取外周血5ml,提取基因组DNA。针对国内外文献报道的与常染色体显性遗传先天性白内障相关的18 个基因（CRYAA、CRYAB、CRYBA1、CRYBA2、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYGC、CRYGD、CRYGS、GJA3、GJA8、MIP、BFSP、HSF4、PITX3、EPHA2、PAX6）设计引物,进行PCR 扩增,对扩产物进行测序和序列分析,了解这10例家系成员的以上基因是否存在相应的序列。结果 临床眼科检查显示该家系先天性白内障类型为粉尘状白内障。候选基因序列测定显示在CRYAA 第1 个外显子中第6 位碱基发生C→T 置换,氨基酸同为天门冬氨酸。该家系中所有患者均有此改变,而所有的正常家系成员均无此改变。结论 CRYAA 第1个外显子中第6位碱基发生C→T的同义突变可能是导致该家系先天性白内障发生的致病原因。     

高通量测序技术在先天性上睑下垂家系致病基因检测中的应用价值

目的:探讨应用高通量测序技术检测先天性上睑下垂家系中致病基因的价值。方法:采用高通量测序技术对先证者进行致病基因检测,获取致病基因突变位点,通过Sanger测序对高度可疑的位点进行测序验证。通过Sanger法对家系成员及100例正常对照者进行基因检测。结果:采用高通量测序技术测得先证者上睑下垂相关转录基因FOXL2基因发生c.578A>G错义突变,导致密码子由AAG突变为AGG,第193位的赖氨酸突变为精氨酸。采用Sanger测序法检测发现该家系所有患者均携带FOXL2基因c.578A>G错义突变,但家系中表型正常者及100例正常对照者的FOXL2基因c.578均为野生型,未发现突变。结论:该家系致病基因为FOXL2基因发生c.578A>G错义突变,高通量测序技术可用于先天性上睑下垂基因突变的快速检测,对先天性上睑下垂的产前诊断和遗传咨询有一定意义。     

近亲结婚1家系Leber先天性黑矇TULP1基因新突变

目的 检测近亲结婚Leber先天性黑矇(LCA)家系致病基因突变。方法 选择近亲结婚Leber先天性黑矇家系作为研究对象,收集家系成员眼科检查资料和病史,采集外周静脉血,提取DNA。先证者采用全基因组外显子测序技术进行致病基因突变筛查;通过生物信息学分析后得到候选致病突变位点。运用Sanger测序进行验证及家系共分离分析,确定致病性突变位点。结果 基因检测在先证者TULP1基因(MIM#602280)第11号外显子检测到新的纯和错义突变c.C1024G(p.R342G),编码区第1024位的核苷酸C(胞嘧啶)变异为G(鸟嘌呤),变异导致编码蛋白序列内的氨基酸改变p.R342G,第342号氨基酸由精氨酸(Arg)变异为甘氨酸(Gly)。342号氨基酸位点在不同物种间具有高度保守性。生物学信息预测提示为致病性。结论 TULP1基因纯和错义突变c.C1024G:p.R342G是该家系的致病原因。该纯合突变国内外均未见报道,是一种新发现的LCA致病基因突变。本研究扩大了LCA基因突变谱,为LCA基因治疗及发病机制研究提供了依据。     

一个白内障家系的临床特征及基因突变研究

目的对1个先天性绕核粉尘状白内障家系的临床特点及基因突变进行研究,探索先天性白内障发病的遗传机制。方法收集确诊为常染色体显性遗传的一个绕核粉尘状白内障家系的外周静脉血,提取基因组DNA,针对现有国内外文献已报道的与该家系白内障表型相关的10个基因设计引物,对患者基因片段进行扩增和序列分析,比对已发现的10个基因序列,查找是否有序列改变。结果被检查者的10个发病相关基因片段的序列中,GJA3基因的外显子发现杂合性突变位点(912C>A,1372A>G),其余9个与GenBank发表的正常序列相同。结论 GJA3基因外显子上发现了新的杂合性突变位点,其对先天性白内障的作用需进一步的研究。     

常染色体显性遗传玻璃体视网膜脉络膜病变一家系的致病基因筛查及临床分析

目的 使用外显子结合目标区域捕获测序检测常染色体显性遗传玻璃体视网膜脉络膜病变(autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy,ADVIRC)家系的致病基因,并分析其临床表型.方法 收集重庆地区常染色体显性遗传玻璃体视网膜脉络膜病变先证者及4代成员的临床资料,完善眼科检查.采集该家系4例患者及8例健康成员的外周静脉血,提取基因组DNA,运用外显子结合目标区域捕获测序芯片进行测序,并对测序结果进行分析后得到候选致病基因性突变位点.运用PCR和直接测序进行验证,确定致病基因.根据致病基因的临床表型对该家系进行临床分析.结果 基因检测发现第六外显子的杂合突变BEST1(c.704TR＞C),家系患者中出现的小角膜、先天性白内障、周边视网膜脉络膜发育不良、晚期易发生青光眼等符合该突变基因的临床表型.结论 BEST1基因的c.704TR＞C杂合突变为该ADVIRC家系的致病基因之一.     

一个血小板减少伴桡骨缺失综合征家系的遗传学研究及产前诊断

  目的  对一个血小板减少伴桡骨缺失（TAR）综合征家系进行遗传学病因分析及产前诊断。  方法  采用染色体微阵列分析（CMA）、荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和Sanger测序对一个TAR综合征家系进行基因突变分析。提取先证者、父母及姐姐4名家系成员的基因组DNA,行CMA、qPCR和Sanger测序,明确致病突变后对胎儿行产前诊断。  结果  先证者1q21.1存在378 kb杂合缺失,内含RBM8A等基因,RBM8A基因还存在c.-21G>A突变,上述突变分别遗传自父母。产前羊水CMA显示胎儿1q21.1存在378 kb微缺失,基因检测未见RBM8A基因c.-21G>A突变。  结论   RBM8A基因1q21.1杂合性缺失和c.-21G>A是本例TAR综合征家系的遗传学病因,为本家系的遗传咨询及产前诊断提供了依据。     

房间隔缺损家系致病基因筛查分析

目的 通过对一个房间隔缺损先证者的四代家系进行致病突变筛查,利用全外显子测序及Sanger测序等分析基因型和表型之间的关系.方法 回顾性分析在云南省第一人民医院心脏大血管外科就诊的1例房间隔缺损患儿的临床资料,并采用全外显子测序技术对患儿及其弟弟、母亲进行遗传学检测,结合生物信息学分析,寻找导致该家系致病的遗传学病因....     

微滴数字PCR定量检测葡萄膜黑色素瘤患者GNAQ/11突变基因

  目的  探讨基于微滴数字PCR定量检测葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）患者肿瘤组织GNAQ/11突变的可行性。  方法  肿瘤标本取自2009?2015年间在四川大学华西医院确诊并行眼球摘除术的78例UM患者的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织,取标本前所有患者均未进行放疗或化疗。采用回顾性研究,以微滴数字PCR技术检测葡萄膜黑色素瘤GNAQ/11的突变情况,同时Sanger测序对目标基因进行DNA测序,比较两种检测方式结果的一致性。  结果  74例UM患者肿瘤组织GNAQ/11突变频率为91.9%。对Sanger测序与微滴数字PCR技术两种方式检测74例葡萄膜黑色素瘤患者GNAQ/11突变的结果进行一致性检验,Kappa系数=0.436,P=0.001。检测GNAQ/11突变基因的两种方法差异最常见的是Sanger测序没有检测出GNAQ/11突变。Sanger测序结果的出错率在异质突变组高于同质突变组（12/37 vs. 3/16,P=0.53）,但差异无统计学意义。  结论  微滴数字PCR与Sanger测序结果具有较好的一致性,葡萄膜黑色素瘤中GNAQ/11的突变率差异较大。数字PCR检测葡萄膜黑色素瘤患者GNAQ/11突变频率接近报道水平。肿瘤组织DNA来源于FFPE的样本更推荐使用灵敏度高的微滴数字PCR检测基因突变,Sanger测序易出现假阴性结果。     

一个常染色体显性遗传腓骨肌萎缩症2K家系的GDAP1基因突变分析

目的探讨一个腓骨肌萎缩症（CMT）家系的分子遗传发病机制。方法抽取家系成员外周血基因组DNA,应用目标外显 子捕获及二代测序技术对先证者的65个候选基因进行基因突变筛查,并对可疑基因进行Sanger测序验证。采用多序列比对分 析基因序列的保守性,利用PolyPhen-2、PROVEAN和SIFT三种软件进行突变基因功能预测。用PyMOL-1软件对突变基因的 蛋白质结构进行分子模拟。结果先证者GDAP1基因第3外显子检测出1个未见报道的杂合错义突变[c.371A>G（p.Y124C）]。 先证者母亲及弟弟均检出该杂合突变,而其父亲未检测到该突变。多序列比对分析结果显示位于GDAP1蛋白的第124位的酪 氨酸具有高度保守性。三种预测软件预测该突变均为有害突变。分子结构模拟结果显示突变体在124位的氨基酸残基与周围 氨基酸残基的相互作用力减弱,影响蛋白整体的稳定性。结论GDAP1基因突变可能与该AD-CMT家系发病有关,新发现的 c.371A>G突变（p.Y124C）扩展了GDAP1基因的突变谱,但其确切发病机制仍需进一步研究。     

全外显子组测序技术检出Kallmann syndrome患者KAL1基因新突变

目的 分析Kallmann syndrome家系患者的分子遗传机制.方法 利用全外显子组测序技术对先证者进行测序分析,按照ACMG解读规则筛选致病性突变,Sanger测序对所有家系成员验证突变结果.结果 捕获且比对到目标区的碱基量为3418.98Mb,平均测序深度为77.66X,覆盖度为99.23％,共检出5056个变异,3174为罕见变异（RSV）,KAL1基因c.1735_1736insT突变为疑似致病性突变,且满足家系共分离.结论 KAL1基因c.1735 1736insT框移突变为新的疑似致病性突变.     

湖北地区一扩张型心肌病家系致病基因筛查

目的 对湖北地区一个扩张型心肌病家系成员进行致病候选基因筛查,寻求家族性扩张型心肌病致病基因,探讨基因型和表型关系.方法 先证者及其家族成员来自湖北省大冶市,先证者于2017年4月在武汉大学人民医院确诊为扩张型心肌病,已有家族成员死亡.详细询问先证者及其家属成员病史、家族史,并进行体格检查、血液指标、心脏超声和心电图检查.对患者的病史、家族史及检查结果分析.与先证者及其家属签订知情同意书,由武汉大学人民医院临床分子诊断中心对先证者候选致病基因全外显子高通量测序,获得可疑突变后,利用Sanger测序验证家系成员是否存在可疑突变.结果 家系先证者(Ⅲ3)和妹妹(Ⅲ2)携带肌联蛋白(TTN)c.100126A>G(P.Thr33376Ala)错义突变.先证者目前心功能下降并伴有恶性心律失常,而其妹妹无明显临床症状,心脏超声检查无异常.结论 本研究发现湖北地区一家族性扩张型心肌病家系存在TTN基因c.100126A>G(p.Thr33376Ala)错义突变,TTN与扩张型心肌病密切相关,是家族性扩张型心肌病重要致病基因.     

一例β-地中海贫血病例中罕见基因突变的鉴定

目的 对海口市人民医院血液科一例47岁男性经临床检查存在贫血、脾大等症状的疑似β地中海贫血的先证者进行病因确诊,并对其家系成员进一步研究分析。方法 采用血常规、脾脏B超、血红蛋白电泳、跨越断点PCR （Gap-PCR）和高通量测序（next generation sequencing, NGS）技术对先证者和5名家系成员进行检测,评估他们贫血、脾脏肿大和基因突变等方面的情况,采用Sanger测序法对高通量测序所检测出的基因突变进行验证,并通过家系连锁分析确定所检测基因突变的遗传方式。结果 先证者同时检测出HBB:c.2T>G和HBB:c.-113A>G两种突变,其中HBB:c.2T>G为常见β突变,HBB:c.-113A>G为新的突变,其母亲及儿子均检出HBB:c.-113A>G杂合突变,其女儿检出HBB:c.2T>G杂合突变,除先证者外其他家系成员并未表现出明显的地贫症状。结论 HBB:c.2T>G杂合复合HBB:c.-113A>G杂合突变会加重β地贫的临床表现,进而表现出脾大症状,该基因突变的发现,丰富了地贫基因突变数据库。全面的检测技术应用于地贫常规检测对临床病人的病因确诊、治疗和遗传咨询都具有重要意义。     

目标区域测序诊断CRB1突变导致的视网膜变性

目的 研究一例疑是视网膜变性的患儿,进行基因检测并作出明确的基因诊断。方法 常规检查患儿和家属的眼睛,特别是视网膜的情况。收集患者及家庭成员的外周静脉血液,提取基因组DNA。通过目标区域外显子组序列捕获联合新一代测序(简称目标区域测序),利用生物信息学分析筛选出一系列可能的突变,再通过Sanger测序和共分离研究进行验证,从而确定先证者的致病突变。最后,通过PCR和Sanger测序检测突变基因。结果 患儿视力障碍严重,眼底检查所见符合视网膜变性。其他人眼睛正常。基因诊断结果表明,先证者携带CRB1基因的复合杂合性致病突变(c.3521G>C和c.1141_1142 insTGGCT)。这两个突变分别来源于父亲(c.3521G>C, p.C1174S)和母亲(c.1141_1142insTGGCT),为隐性遗传。患儿的弟弟(新生儿)只有一个c.1141_1142 insTGGCT突变,表明他不会发病。建议新生儿长大后在生育前要进行遗传检查和咨询。结论 目标区域测序的基因诊断方法是检测视网膜变性疾病突变基因的强大工具,有利于对患者做出早期、明确、分子水平的诊断,在特定疾病的理解、预防和预后判定方面能发挥重要作用。同时为其尚无法做临床检查和诊断的新生儿弟弟进行了基因诊断,通过预测,排除了发病的可能。     

CLN6基因复合杂合突变导致神经元蜡样脂褐质沉积症一家系遗传学研究

目的: 探讨一个常染色体隐性遗传神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）家系的遗传学原因。方法: 应用目标区捕获高通量靶向测序对先证者进行候选基因突变筛查,并通过PCR测序在先证者及其父母中对突变位点进行验证;RT-PCR及TA克隆测序考察上述两种突变是否影响剪接。结果: 测序结果显示先证者存在CLN6：c.486+2T>C和c.486+4A>T复合杂合突变,分别来自父母双方。RT-PCR及TA克隆测序提示两种突变均可导致两种异常剪接。结论: CLN6：c.486+2T>C和c.486+4A>T复合杂合突变很可能为该NCL家系患者的遗传学病因,新突变基因丰富了CLN6基因突变谱。