高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞损伤及机制的研究

目的:观察高糖诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2)损伤及机制。方法:细胞生长融合至约80%时,用DMEM低糖培养基无血清同步化48 h,然后分为以下7组。①正常糖对照组(5.5 mM低糖DMEM培养基,NG);②高糖1组(15 mM高糖DMEM培养基,HG1);③高糖2组(30 mM高糖DMEM培养基,HG2);④高糖3组(45 mM高糖DMEM培养基,HG3);⑤高糖4组(60 mM高糖DMEM培养基,HG4);⑥等渗1组(30 mM甘露醇DMEM培养基,HM1);⑦等渗2组(45 mM甘露醇DMEM培养基,HM2)。观察不同糖浓度(5.5~45 mM)刺激HK-2细胞24 h,观察IκBα和p65蛋白表达规律。MTT比色法检测细胞活力。Western blot法检测IκBα和p65蛋白表达。结果:高糖2组、高糖3组、高糖4组浓度呈依赖性对HK-2活力存在显著的抑制作用(P0.05,P0.01);高糖2组、高糖3组浓度的甘露醇对HK-2活力没有明显的抑制作用(P0.05)。IκBα蛋白表达随着葡萄糖浓度的升高而依次降低,而p65蛋白表达呈浓度依赖性升高,高糖2组、高糖3组的葡萄糖与正常糖对照组比较,差异有显著性或非常显著性意义(P0.05,P0.01)。结论:高糖诱导的HK-2毒性损伤呈一定的浓度依赖关系,其机制与NF-κB通路的激活有关,与渗透压作用无明显关联。     

芝麻素对高糖损伤SH-SY5Y细胞的保护效果及机制

目的研究芝麻素(sesamin)对高糖所致人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用及其机制。方法SH-SY5Y细胞接种于含100 mmol/L葡萄糖的培养基并与10、20、40μmol/L芝麻素共同孵育36 h,MTT法测定细胞存活率,比色法测定细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)水平,ELISA检测DNA片段及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性。2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)的水平,试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)活性。光度法检测细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性,实时荧光定量检测NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达。Western blot法检测p47phox蛋白表达。结果芝麻素可增加高糖作用下SH-SY5Y细胞的存活率,抑制细胞LDH释放,阻止高糖诱导的DNA断裂,降低Caspase-3活性。同时芝麻素能够增加高糖作用下SH-SY5Y细胞内SOD、CAT和GSH的活性,清除细胞内的ROS,抑制NADPH氧化酶活性及p47phox mRNA和蛋白的表达。结论芝麻素对高糖诱导SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与抗氧化和抑制NADPH氧化酶活性有关。     

D159687减轻神经元氧化应激损伤的作用机制研究

目的研究D159687对过氧化氢(H_2O_2)所致的小鼠海马神经元HT22细胞损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法实验分为正常对照组、模型组、D159687 0.5μmol/L组、D159687 1μmol/L组、D159687 2μmol/L组、D159687 4μmol/L组。将HT22细胞株接种于96孔板,对照组采用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养,其他组加入不同浓度的D159687进行干预培养,后经H_2O_2损伤。CCK-8法测定各组细胞存活率,Western blot法检测Caspase-3和NADPH氧化酶亚基gp91phox、p47phox表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡情况,并测定各组细活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果模型组细胞存活率、SOD活性均显著低于正常对照组(P均0.05),ROS表达水平、MDA含量及Caspase-3、p47phox、gp91phox蛋白表达水平均显著高于正常对照组(P均0.05);D159687 0.5μmol/L组、D159687 1μmol/L组、D159687 2μmol/L组、D159687 4μmol/L组细胞存活率、SOD活性显著高于模型组(P均0.05),ROS表达水平、MDA含量及Caspase-3、p47phox、gp91phox蛋白表达水平均显著低于模型组(P均0.05)。结论在0.5～4μmol/L浓度范围内,D159687浓度依赖性地拮抗H_2O_2所致HT22细胞损伤,同时抑制HT22细胞凋亡,这种作用可能与其抑制NADPH氧化酶关键亚基gp91phox和p47phox蛋白表达有关。     

金匮肾气汤对单侧输尿管梗阻大鼠氧化应激和自噬的影响

目的探讨金匮肾气汤对单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾间质纤维化中氧化应激和自噬的影响。方法将24只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、金匮肾气汤组(1.8 g·kg~(-1))、依那普利组(10 mg·kg~(-1));左侧输尿管结扎术后第1天开始灌胃给药(10 mL·kg~(-1)),每日1次,第21天处死大鼠。取梗阻肾组织,采用Masson染色法观察肾组织病理改变;化学荧光法检测梗阻肾组织活性氧(ROS)含量;Western Blot法检测NOX4、p22~(phox)、p47~(phox)、LC3II/I、p62、p-mTOR/mTOR及p-AMPK/AMPK等蛋白在梗阻肾组织中的表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠梗阻肾组织间质胶原沉积增多,ROS含量显著增高(P0.01),NOX4、p22~(phox)和p47~(phox)蛋白表达显著上调(P0.01),LC3II/LC3I蛋白表达比例显著下调、p62蛋白表达显著上调(P0.01),AMPK磷酸化显著减少、mTOR磷酸化明显增加(P0.01)。与模型组比较,金匮肾气汤组大鼠梗阻肾组织间质胶原沉积减少,ROS含量显著降低(P 0.05),NOX4、p22~(phox)和p47~(phox)蛋白表达显著下调(P 0.05),LC3II/LC3I蛋白表达比例上调、p62蛋白表达下调(P 0.05),AMPK磷酸化增加、mTOR磷酸化减少(P 0.05)。结论金匮肾气汤可能通过抑制NOX4激活,进而通过AMPK-mTOR途径促进梗阻肾组织自噬,从而改善UUO导致的肾间质纤维化。     

茶多糖对高糖诱导下HK-2细胞氧化应激损伤的保护作用及TGF-β_1、α-SMA表达的影响

目的:研究茶多糖(TPS)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)的氧化应激损伤的保护作用及其机制,探讨茶多糖对高糖诱导下HK-2细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。方法:DCFH-DA(组织活性氧荧光定量)法检测茶多糖对高糖刺激下HK-2细胞内活性氧(ROS)水平的影响。RTPCR检测TGF-β1、α-SMA m RNA的表达。Western-blot检测核因子NF-E2相关因子(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)、TGF-β1、α-SMA蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,高糖组ROS水平显著升高,经茶多糖干预后,ROS水平显著降低,其作用呈浓度依赖性;与正常对照组比较,高糖组Nrf2、HO-1蛋白表达均显著升高,经茶多糖干预后,与高糖组比较,Nrf2、HO-1蛋白表达均显著升高;与正常对照组比较,高糖组TGF-β1、α-SMA m RNA和蛋白表达均显著升高,经茶多糖干预后,TGF-β1、α-SMA m RNA和蛋白表达均显著降低。结论:茶多糖能减少高糖诱导的氧化应激损伤,其机制与激活Nrf2/ARE途径有关。茶多糖能降低TGF-β1和α-SMA的表达,减少高糖诱导下HK-2细胞EMT的发生。     

山萘酚和芒柄花黄素对缺氧心肌细胞内NADPH氧化酶相关亚基的调控作用

目的:分析中药单体山萘酚和芒柄花黄素对缺氧条件下H9c2心肌细胞内活性氧水平及NADPH氧化酶亚基NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)表达量的影响。方法:采用缺氧造模的方法对H9c2心肌细胞进行造模,通过倒置荧光显微镜观察DCFH-DA染色的H9c2心肌细胞的荧光强弱;Real time PCR和Western blot检测NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)表达量变化。结果:各组细胞内绿色荧光有显著变化,即对照组的细胞内荧光微弱,模型组荧光强度显著增强,各给药组荧光强度有所减弱,作用与阳性药组相似;山萘酚能够有效降低NOX4、p67~(phox)、p47~(phox) mRNA的表达量,芒柄花黄素能够有效降低NOX4、p47~(phox) mRNA的表达量;山萘酚能够有效降低NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)蛋白的表达量,芒柄花黄素能够有效降低NOX4、p67~(phox)蛋白的表达量。结论:抑制NOX4、p67~(phox)、p47~(phox)的表达量可能是山萘酚和芒柄花黄素发挥抗氧化作用的重要环节,而对于NADPH氧化酶的影响反映了H9c2心肌细胞内活性氧的水平。     

槲皮素保护H2O2诱导的H9C2心肌细胞氧化损伤的作用机制

目的:探讨在H_2O_2诱导的氧化应激损伤中槲皮素对H9C2心肌细胞存活率、活性氧分子(ROS)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶、细胞凋亡等关键因子的影响,初步阐明槲皮素对心肌细胞的保护机制。方法:H_2O_2刺激H9C2心肌细胞建立氧化应激损伤模型,分为正常组、模型组、槲皮素组,采用噻唑蓝(MTT)法检测心肌细胞活力,活性氧检测试剂盒检测槲皮素处理后ROS变化,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测细胞氧化应激反应、细胞凋亡机制相关分子[NADPH氧化酶-4(NOX-4),NADPH氧化酶亚单位p22phox,B淋巴细胞瘤-2原瘤基因(Bcl-2),Bcl-2相关X基因(Bax),半胱胺酸蛋白酶-8(Caspase-8)]基因和蛋白表达水平。结果:10μmol·L-1槲皮素具有显著的抗氧化、抗凋亡作用。与模型组比较,槲皮素组细胞存活率明显提高(P0.05),ROS水平与细胞凋亡率明显降低(P0.05,P0.01)。此外,槲皮素组中Bcl-2,NOX-4基因表达上调(P0.05);p22phox,Bax,Caspase-8基因表达明显下调(P0.05)。同时槲皮素能够抑制Bax,p22phox蛋白的表达(P0.05),上调磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K),Bcl-2蛋白的表达(P0.05)。结论:10μmol·L-1槲皮素能有效减少H_2O_2介导的心肌细胞氧化损伤,进而抑制心肌细胞凋亡。该机制可能是通过调节NADPH氧化酶亚型NOX-4与p22phox,减少ROS生成,激活PI3K表达,升高Bcl-2实现。     

糖肾清2号提取物调控AMPK信号通路对高糖环境下肾小球系膜细胞炎症因子表达的影响

目的:观察糖肾清2号提取物对高糖环境下的小鼠肾小球系膜细胞株AMPK-α1、IκBα、TLR-4mRNA转录和蛋白表达的影响,探讨该方抑制高糖环境下肾小球系膜细胞株免疫炎性病理损伤的分子机制。方法:采用小鼠肾小球系膜细胞株SV40 MES 13,在5%CO_2、37℃恒温培养箱常规培养。实验分组:空白对照组(D-葡萄糖5.6 mmol/L)、高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L)、中药低浓度组(高糖+糖肾清2号提取物5μmol/L)、中药中浓度组(高糖+糖肾清2号提取物10μmol/L)、中药高浓度组(高糖+糖肾清2号提取物20μmol/L),共同孵育12、24、36 h进行指标检测。采用RT-PCR技术检测肾小球系膜细胞AMPKα1、IκBα、TLR4 mRNA转录水平;Western-blot技术检测肾小球系膜细胞AMPKα1、IκBα、TLR4的蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,高糖组AMPKα1、IκBαmRNA转录水平及蛋白表达下调(P0.05),TLR4 mRNA转录水平及蛋白表达水平上调(P0.01),差异有统计学意义。与高糖组比较,中药各浓度组AMPKα1、IκBα蛋白表达水平上调(P0.05),中药高、低浓度组AMPKα1、IκBαmRNA转录水平上调(P0.05)。中药各浓度组TLR4mRNA转录水平下调(P0.01),中、高浓度组TLR4蛋白表达水平下调(P0.01)。结论:糖肾清2号抑制高糖环境下肾小球系膜细胞免疫炎性代谢性损伤,此分子机制可能与调节AMPK信号通路相关。     

大黄虫丸对H2O2诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

目的研究大黄■虫丸对H_2O_2诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响,并探讨其分子机制。方法制备大鼠大黄■虫丸血清和正常血清;将肝星状细胞(HSCs)分为正常血清低浓度H_2O_2(50 nmol/L)组、大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组、正常血清高浓度H_2O_2(100μmol/L)组和大黄■虫丸血清高浓度H_2O_2组,应用化学荧光和流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平。蛋白质免疫印迹实验中,将HSCs分为正常血清组、大黄■虫丸血清组、正常血清低浓度H_2O_2(50 nmol/L)组和大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组,以检测ROS生成相关分子RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK的表达。结果正常血清高浓度H_2O_2组和大黄■虫丸血清高浓度H_2O_2组细胞内均有较强ROS荧光,但两组之间差异无统计学意义(P0.05);大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组细胞的ROS荧光强度明显弱于正常血清低浓度H_2O_2组(P0.01);与正常血清组比较,正常血清低浓度H_2O_2组RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与正常血清低浓度H_2O_2组比较,大黄■虫丸血清低浓度H_2O_2组RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK蛋白表达下调(P0.01)。结论大黄■虫丸可能通过调控RAC1、p67~(phox)、p22~(phox)和p-ERK等分子,参与拮抗H_2O_2诱导的氧化应激,阻止ROS的生成,并最终抑制HSCs活化、增殖,防治肝纤维化。     

丹蛭降糖胶囊联合运动对糖尿病大鼠胰腺NADPH氧化酶亚单位p22phox表达水平的影响

目的 探讨益气养阴活血方丹蛭降糖胶囊联合运动对糖尿病大鼠胰腺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶亚单位22 kD多肽（p22phox）蛋白表达水平的影响。方法 雄性Wistar大鼠60只,分为正常组、模型组、运动组、丹蛭降糖胶囊组（简称中药组）及丹蛭降糖胶囊加运动组（简称中药加运动组）,用小剂量链脲佐菌素（STZ）联合高脂饲料的方法建立糖尿病大鼠模型,用免疫组化法检测大鼠胰腺组织中p22phox、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-de-axyguanine, 8-OHdG）的表达,用Western blot检测各组p22phox表达水平。结果 模型组p22phox、8-OHdG的表达水平明显高于正常组,差异有统计学意义（P<0.01）,免疫组化观察到p22phox、8-OHdG主要在胰岛细胞胞浆中表达,中药、运动能明显降低p22phox、8-OHdG水平（P<0.01）,运动与中药联用对降低p22phox、8-OHdG水平有协同作用（P<0.05）。结论 运动、丹蛭降糖胶囊及两者联用能降低NADPH氧化酶的表达,减少氧化应激的来源,从而保护胰岛β细胞。     

梓醇抑制NADPH氧化酶保护2型糖尿病早期血管内皮功能

该研究观察梓醇对2型糖尿病(T2DM)大鼠血管内皮功能的保护作用并探讨其抑制NADPH氧化酶表达的机制。40只高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素致糖尿病大鼠随机分为模型组、梓醇低、中、高剂量组(10,50,100 mg·kg-1·d-1)。另以10只健康Wistar大鼠作为正常组。正常组、模型组分别给予相当量的生理盐水。6周后全自动生化分析仪检测血糖、血脂;ELISA检测血清8-异前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)含量;硝酸还原法检测血清一氧化氮(NO)水平;羟胺法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)含量;观察离体胸主动脉环内皮依赖性血管舒张反应;荧光法检测主动脉组织活性氧(ROS)的水平;HE染色观察主动脉病理形态学改变;RT-PCR,western-blot分别检测主动脉组织Nox4,p22phox mRNA及蛋白表达。结果显示梓醇中、高剂量组血管内皮损伤明显减轻,主动脉ROS水平降低,血清NO水平升高,8-iso-PGF2α含量减少,SOD含量升高;主动脉组织Nox4,p22phox mRNA及蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。因此梓醇对T2DM血管内皮具有保护作用,其机制可能与其下调Nox4,p22phox表达,抑制氧化应激反应有关。     

苦参碱对LPS诱导的阿尔茨海默病小鼠模型学习记忆功能和脑内神经炎症的影响

目的:研究苦参碱对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠学习记忆损伤的治疗作用并探讨其可能的作用机制。方法:ICR小鼠随机分为正常组、模型组、苦参碱高、中、低剂量组和阳性药组。除正常组之外其余各组小鼠侧脑室注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立AD小鼠模型,正常组小鼠注射等量生理盐水。之后连续灌胃给药21 d,每天1次,其中苦参碱各给药组高、中、低剂量分别为40,20,10 mg·kg~(-1),阳性药多奈哌齐剂量为5 mg·kg~(-1)。采用新物体识别(novel object recognition,NOR)实验,Y迷宫实验评价各组动物的学习记忆能力;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组小鼠脑内海马组织中炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL~(-1)β)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠脑内海马区烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基gp91phox,p47phox蛋白的含量。结果:与正常组比较,模型组小鼠的新物体偏爱指数和自发交替反应率明显降低(P 0. 01),海马组织中TNF-α,IL~(-1)β和ROS的含量明显升高(P 0. 01),NADPH氧化酶亚基gp91phox,p47phox蛋白的表达明显升高(P 0. 01)。与模型组比较,苦参碱高、中、低剂量组均可使小鼠的新物体偏爱指数和自发交替反应率明显升高(P 0. 05,P 0. 01),明显改善AD小鼠的学习记忆能力;同时,苦参碱各剂量组可显著降低AD模型小鼠海马组织中TNF-α,IL~(-1)β和ROS的含量(P 0. 05,P 0. 01),并下调NADPH氧化酶亚基gp91phox,p47phox蛋白的表达(P 0. 05,P 0. 01)。结论:苦参碱可缓解LPS诱导的学习记忆功能损伤和脑内神经炎症,这些作用可能是通过抑制NADPH氧化酶亚基gp91phox和p47phox的蛋白表达来发挥的。     

三七总皂苷对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的研究

目的 探讨三七总皂苷(PNS)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响及机制.方法 体外培养人HK-2细胞并分为3组:正常对照组(含5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(含25 mmol/L D-葡萄糖)和高糖+PNS组;48h后细胞免疫化学方法测定各组HK-2细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),用ELISA法检测细胞培养上清中纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)和细胞转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达.结果 对照组HK-2细胞形态为立方形铺路石样,未见α-SMA阳性表达;高糖组细胞变为梭形长条样,α-SMA的表达也明显增多(P＜0.05);治疗组细胞大部分仍呈立方形铺路石样,α-SMA的表达明显下降(P＜0.05).高糖组TGF-β1与FN浓度显著高于对照组(均P＜0.01),治疗组TGF-β11与FN的表达明显低于高糖组(均P＜0.01).α-SMA的表达与TGF-β1、FN的表达呈正相关.结论 PNS可能通过抑制肾小管上皮细胞α-SMA的表达和细胞外基质分泌,从而抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,对糖尿病肾病有一定防治作用.     

清燥救肺汤对肺癌磷酸戊糖能量代谢途径的关键酶G6PD活性及其调控因子的影响

目的:观察清燥救肺汤对肺癌磷酸戊糖能量代谢途径6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)活性及其调控因子的影响,探讨其机制。方法:50只雄性C57BL6J小鼠,通过随机分组,分为模型组、环磷酰胺组、清燥救肺汤高、中、低剂量组,每组10只。右腋下注射Lewis肺癌细胞建立肺癌荷瘤模型,清燥救肺汤高、中、低剂量组分别以11,5.5,2.8 g·kg^-1·d^-1造模前2周开始灌胃给药,环磷酰胺组以50 mg·kg^-1·(2 d)-1腹腔注射给药,模型组以等体积生理盐水灌胃给药,接种后继续给药2周后处死各组小鼠并取瘤组织,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测G6PD活性及小鼠活性氧(ROS)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测癌组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基单位gp91phox和p22phox mRNA的表达。结果:与模型组比较,清燥救肺汤高、中、低剂量组及环磷酰胺组G6PD活性明显降低(P<0.05,P<0.01);清燥救肺汤高、中、低剂量组及环磷酰胺组ROS含量,NADPH氧化酶亚基单位gp91phox,p22phox mRNA表达显著降低(P<0.01)。结论:清燥救肺汤可能通过抑制NADPH氧化酶表达,减少ROS含量,抑制G6PD的表达,发挥抑制肺癌细胞能量代谢及细胞增殖的功效。     

针刺对高血压大鼠延髓头端腹外侧区氧化应激水平影响的研究

目的:从自由基来源和清除的角度探讨针刺对自发性高血压大鼠(SHR)延髓头端腹外侧区(RVLM)中氧化应激水平影响的潜在机制。方法:15只Wistar(WKY)大鼠为正常组,45只SHR大鼠随机分为高血压组、针刺组和非穴组。针刺组取“太冲穴”直刺,非穴组取非穴位浅刺,治疗1次/d,共14 d。采用遥测技术检测针刺对血压的影响;采用DHE染色检测针刺对RVLM中活性氧族(ROS)变化的影响;采用化学发光法检测针刺对RVLM中超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS),和NADPH氧化酶活性的影响;采用Western Blot检测针刺对RVLM中NADPH氧化酶、SOD、NOS各亚基或亚型蛋白表达的影响。结果:与正常组比较,高血压组大鼠收缩压显著增高(P<0.05),RVLM中ROS产生增多(P<0.05),NADPH氧化酶活性增高(P<0.05),其亚基gp91phox、p22phox和nNOS蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与高血压组和非穴组比较,针刺干预可显著下调SHR大鼠的收缩压(P<0.05),降低RVLM中ROS的水平(P<0.05),下调NADPH氧化酶活性(P<0.05)。各组中SOD和NOS活性,SOD1、SOD2和iNOS蛋白表达水平无显著改变。结论:针刺可显著改善SHR大鼠血压,降低RVLM中ROS的水平,其机制可能与下调NADPH氧化酶亚基gp91phox、p22phox、及NOS亚型nNOS的表达水平相关。     

人参三七川芎提取物延缓内皮细胞复制性衰老的机制研究

目的:探讨人参三七川芎提取物对内皮细胞复制性衰老(humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影响.方法:体外培养的HUVEC-2C传代至第8代,造成内皮细胞复制性衰老模型.细胞分为4组,8代衰老模型组、维生素E(Vit E)组(50 mg·L~(-1))、中药高、低(50,20 mg·L~(-1))剂量组,采用衰老相关卢β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法观察细胞衰老改变,流式细胞仪分析细胞周期,激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量,硝酸还原酶法检测培养液一氧化氮(NO)和抗超氧阴离子水平,Western-blot法检测各组细胞AngII1型和2型受体(AT_1R和AT_2R),NAD(P)H氧化酶p47phox的蛋白表达.结果:8代衰老模型组β-gal染色阳性细胞数明显增多,细胞停滞在G_0/G_1期,激光共聚焦显微镜下ROS荧光强度明显增强,培养液中抗超氧阴离子、NO含量减少,p47phox,AT_1R,AT_2R蛋白表达上调.给予高、低剂量中药处理后,可明显改善细胞的衰老状态,β-gal染色阳性细胞数减少,G_0/G_1期细胞减少,G_2/M期细胞增加,ROS荧光强度减弱,抗超氧阴离子、NO含量较8代衰老模型组增加,p47phox,AT_1R,AT_2R蛋白表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论:人参三七川芎提取物能够延缓内皮细胞复制性衰老,通过活性氧途径下调NADPH氧化酶p47phox的表达,最终使ROS产生减少;同时,中药提取物还能降低衰老内皮细胞AT_1R,AT_2R的表达,改善内皮功能,这可能是益气活血中药延缓内皮细胞衰老的主要原因之一.     

胡芦巴丸调控氧化应激通路改善大鼠糖尿病肾病的实验研究

目的：探讨胡芦巴丸及其单味药抗氧化应激治疗大鼠糖尿病肾病（DKD）的分子机制。方法：采用高糖高脂饮食和尾静脉小剂量链脲佐菌素（STZ）的方法建立大鼠糖尿病肾病模型,将大鼠随机分为模型组、胡芦巴组、补骨脂组、胡芦巴丸组、卡托普利组,另设正常对照组,给予相应药物灌胃治疗16周后,检测血糖、血脂、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿24 h总蛋白（UTP）、尿24 h尿白蛋白（UALB）,光镜下观察肾脏形态学改变（HE染色、PAS染色、Masson染色）、电镜下观察肾脏超微结构改变,DHE染色评估肾脏组织超氧阴离子水平,浓度比色法检测肾组织烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）活性,Western Blotting检测肾脏组织磷酸化蛋白激酶C-α（PKC-α、NADPH氧化酶p47phox亚基、纤黏蛋白（Fibronectin）的表达水平,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测肾脏组织p47phox、PKC-α的mRNA表达水平。结果：与正常组比较,模型组大鼠血糖升高、血脂紊乱,24 h尿总蛋白及白蛋白水平均明显升高（P<0.001）,肾小球体积增大、肾小球纤维化、细胞外基质增生、足细胞足突融合;与模型组比较,胡芦巴、补骨脂、胡芦巴丸组大鼠血糖水平下降,血脂紊乱改善,24 h尿总蛋白及白蛋白水平均明显下降（P<0.01）,上述肾脏病理学改变明显减轻。与正常组比较,模型组大鼠肾组织DHE染色荧光强度明显升高,肾组织NADPH氧化酶活性、磷酸化PKC-α、p47phox、Fibronectin蛋白均明显升高（P<0.001）;与模型组比较,胡芦巴、补骨脂、胡芦巴丸组大鼠肾组织DHE染色荧光强度明显降低,肾组织NADPH氧化酶活性、磷酸化PKC-α、p47phox、Fibronectin蛋白均明显降低（P<0.01）,p47phox、PKC-α的mRNA表达水平降低（P<0.01）。与单味药比较,胡芦巴丸复方组在抗氧化应激,改善肾小球纤维化,降低血脂血糖优于胡芦巴组和补骨脂组。结论：胡芦巴丸通过抑制PKC-α/NADPH通路抗氧化应激以治疗糖尿病肾病。     

糖肾清2号方对糖尿病肾病小鼠AMP激活蛋白激酶信号通路的影响

目的观察糖肾清2号方对糖尿病肾病模型小鼠AMP激活蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法采用自发性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠,予高脂饲料诱导3周诱导糖尿病肾病模型。造模成功的小鼠随机分为模型组,阳性药组,中药大、中、小剂量组,以C57BL/6J小鼠设为正常组,每组各6只。正常组及模型组予去离子水0.1 mL/(10 g·d),阳性药组予缬沙坦13.33 mg/(kg·d),中药大、中、小剂量组分别按照糖肾清2号方生药量40.66、20.33、10.17 g/(kg·d)剂量灌胃。各组小鼠每日灌胃1次,连续干预治疗12周后取血清及肾脏。采用RT-PCR技术检测肾脏组织AMPK-α1、NF-κB P65、TNF-α、IL-6 mRNA转录水平。Western blot技术、免疫组化法测定肾脏组织AMPK-α1、NF-κB P65蛋白表达水平。ELISA法检测血清TNF-α、IL-6蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组AMPK-α1 mRNA转录水平及蛋白表达水平明显下调(P0.01),NF-κB P65、IL-6、TNF-αmRNA转录水平及蛋白表达水平明显上调(P0.01)。与模型组比较,中药大、中、小剂量组AMPK-α1 mRNA及蛋白表达均有上调(P0.05,P0.01),NF-κB P65、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白表达水平均明显下调(P0.05,P0.01)。与阳性药组比较,中药各组AMPK-α1 mRNA转录水平及蛋白表达水平明显下调(P0.01),NF-κB P65、TNF-α、IL-6 mRNA水平均明显上调(P0.01),NF-κB P65、IL-6蛋白表达水平均明显上调(P0.05,P0.01);中药大、中剂量组TNF-α蛋白表达水平明显下调(P0.05)。结论糖肾清2号方对肾脏的保护作用可能与激活AMPK-α1活性,间接抑制NF-κB活性从而抑制炎症反应有关。     

参地补肾胶囊含药血清对高糖诱导转分化HK-2细胞ZO-1、α-SMA表达的影响

目的:通过观察参地补肾胶囊含药血清对高糖诱导转分化的人肾小管上皮(HK-2)细胞ZO-1(紧密连接蛋白)、α-SMA(α平滑肌肌动蛋白)表达的影响,从分子生物学水平探讨参地补肾胶囊干预肾小管上皮细胞转分化的机制。方法:制备空白及参地补肾胶囊、贝那普利含药血清,以高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)作为观察对象,实验分为正常对照组、高糖模型组、参地补肾胶囊组和贝那普利组,各组HK-2细胞培养48 h,采用Western Blot方法检测ZO-1、α-SMA蛋白的表达情况,Real-time PCR技术检测ZO-1mRNA的表达情况。结果:与高糖模型组比较,贝那普利组、参地补肾胶囊组HK-2细胞ZO-1表达量增加(P 0. 05),参地补肾胶囊组ZO-1表达较贝那普利组增强(P 0. 05);贝那普利组及参地补肾胶囊组HK-2细胞a-SMA表达均低于高糖模型组(P 0. 05),参地补肾胶囊组aSMA表达低于贝那普利组(P 0. 05);参地补肾胶囊组ZO-1mRNA表达增加(P 0. 05),高于贝那普利组(P 0. 05)。结论:参地补肾胶囊可能是通过调节细胞ZO-1、α-SMA的表达抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化。     

竹节参总皂苷通过调节AMPK/Sirt1/NF-κB通路抑制衰老大鼠心肌细胞凋亡的作用研究

研究竹节参总皂苷(saponins extracted from Panax japonicus,SPJ)对自然衰老大鼠心肌细胞凋亡的调节作用及其作用机制。将SD雄性大鼠随机分为青年对照组、自然衰老组、SPJ低剂量组、SPJ高剂量组,每组10只。自然衰老组、SPJ低、高剂量组从18月龄开始分别灌胃给予生理盐水、SPJ 10,60 mg·kg~(-1)·d-1,每周灌胃6 d,持续6个月至24月龄处理动物。HE染色观察各组大鼠心肌形态;Tunel法检测心肌细胞凋亡;Western blot检测各组大鼠心肌组织中Bcl-2,Bax,IL~(-1)β,TNF-α,AMPK,p-AMPK,Sirt1,Ac-NF-κB p65蛋白表达。SPJ能有效改善自然衰老大鼠心肌纤维的排列紊乱,减少炎性细胞浸润,抑制心肌细胞凋亡。同时,SPJ能明显抑制自然衰老过程中心脏组织Bax,IL~(-1)β,TNF-α,Ac-NF-κB p65的表达,促进Bcl-2,Bcl-2/Bax,p-AMPK/AMPK,Sirt1蛋白表达。SPJ可有效抑制自然衰老大鼠心肌细胞凋亡,其作用机制可能与调节AMPK/Sirt1/NF-κB通路介导的炎症反应有关。