人SPK1基因的重组腺病毒载体感染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒载体感染小鼠神经瘤细胞(N2a)的感染效率及重组腺病毒介导的人鞘氨醇激酶-1(sphingosinekinase-1,SPK1)基因在N2a细胞表达特性.方法用流式细胞仪检测感染效率,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;用 Westernblot方法检测SPK1蛋白的表达.结果 N2a细胞的感染效率和绿色荧光蛋白表达量在一定范围内随着病毒感染复数(Multiplicityofinfection,MOI)的增加而增高,MOI为100时感染效率达峰值为(99.57±0.133)%.以 MOI为25的重组腺病毒感染N2a细胞,感染效率随时间变化(0-72h)而增高,72h峰值为(98.03±0.721)%,到96h有所降低(P<0.05).SPK1蛋白的表达量较感染空病毒组和未感染病毒组明显升高.结论重组腺病毒在适宜的 MOI下,在N2a细胞中96小时内均有较高的感染效率,且重组腺病毒介导的人SPK1基因在体外能够得到有效的表达.     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌的实验研究

目的:研究重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌(HASMCs)的方法。方法:用组织贴块原代培养传代至3～8代的HASMCs,重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染,荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率,CCK-8法检测其对细胞的毒性。结果:随着MOI增高,转染效率增高。MOI=100时Ad-GFP对HASMCs的感染效率可达(96±0.32)%,以感染后48h达高峰,持续7d仍有绿色荧光表达;转染后的细胞与未转染细胞相比,细胞毒性无统计学差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因Ad-GFP能高效转染HASMCs,转染后对细胞无毒性,是一种安全的基因载体。     

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

背景:肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成,已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗.目的:鉴于重组腺病毒的宿主范围广,探讨重组腺病毒介导的入肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、日的蛋白表达及细胞活性的影响.设计、时间及地点:2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验.材料:清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠.方法:向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导.以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞.主要观察指标:油红O染色检测成脂情况.流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达,计算转染效率.EUSA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达,MTT法检测转染脂肪细胞的活性.结果:①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴,成脂率(97.31±0.46)%.②以100 pfu/cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72 h后,绿色荧光蛋白表达量达高峰,此时转染效率为65.39%.③以100 pfu/cell作为最佳感染强度转染脂肪绌胞72 h后,肝细胞生长因子的表达量为峰值.与未转染空白对照比较,转染后24,48,72,96,168 h脂肪细胞活性均无明显变化(t=0.024～0.092,P>0.05).结论:重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞,有效表达目的蛋白,且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响.     

重组腺病毒对体外培养耳蜗Corti器的转染特性

目的:腺病毒载体是在内耳基因治疗的实验研究中应用最广泛的载体之一,但载体的靶向性不明显。通过重组腺病毒携带报告基因EGFP转染体外培养耳蜗器官,观察各型细胞的转染特性。方法:实验于2004-08/2006-01在美国纽约州立大学布法罗分校听力耳聋研究中心完成。①实验材料:Fisher大鼠来源于布法罗大学的实验动物中心。AdV/EGFP是Buffalo大学Dr.Lee惠赠。②实验方法:选取出生3d的大鼠分离获取耳蜗组织。使用携带报告基因-EGFP的重组腺病毒(AdV/EGFP),以1×107,1×108,1×109,2×109VP/mL作用耳蜗,于感染后6,12,24,48h和3d,固定组织,观察感染特性。分离出生3d的大鼠耳蜗Corti器,基底膜分离后,立即进入2mL滴度为1×109VP/mL,含2mmol/L的庆大霉素病毒溶液,作用3h后平铺到胶粒上,加入含2mmol/L庆大霉素的生长培养基,作用24h后收获样品。③实验评估:采用TRITC-labeledphaloidin组织化学染色,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白EGFP和TRIC在耳蜗细胞中的表达定位。结果:①重组腺病毒可转染离体培养耳蜗组织中的各种类型细胞,外沟细胞感染率最高,其次为齿间细胞。仅有很少部分的毛细胞和螺旋神经元被感染。②在病毒滴度在107～109VP/mL的范围内,重组腺病毒感染耳蜗具有剂量依赖性,但大于这个滴度并不会增加感染效率,而且高浓度的重组病毒可造成毛细胞和外沟细胞破坏。③EGFP最早于感染后6h出现,48h达到高峰,外源基因高表达至少可维持7d。④庆大霉素损伤所有的毛细胞后,重组腺病毒能够感染多数的Deiters’细胞,齿间细胞的感染效率高于腺病毒对正常耳蜗组织的感染。结论:重组腺病毒转染效率在耳蜗各种类型细胞明显不同,重组腺病毒优先感染耳蜗支持细胞。     

构建含人胰岛素样生长因子基因腺病毒载体及在兔骨髓间充质干细胞的表达

背景:Adeasy腺病毒系统是由T.C.He等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统.相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法,其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒,从而简化了腺病毒的构建和测试流程,而且,它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪,从而在近年来被广泛用作基因转染的载体.目的:用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达.设计:重复测量实验.单位:重庆医科大学儿科研究所.方法:实验于2004-11/2005-03在重庆医科大学儿科研究所完成.①重组腺病毒载体的构建:从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1,按Ad-easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0,电穿孔转化感受态XL-1细菌,扩增后获得重组腺病毒质粒,去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞;②腺病毒包装及扩增:Pae Ⅰ酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0,纯化后转染HEK293细胞,观察GFP的表达,待细胞90%以上漂浮后,冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad-hIGF-1(重组目的腺病毒)和Ad-0(重组空白腺病毒),将收集病毒上清重复多次感染293细胞(乒乓交互感染)以提高病毒滴度.③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5%CO2孵箱培养,隔天换液,10 d细胞融合达70%～80%,贴壁紧密,细胞形态均一,呈典型的涡漩状排列,传代至第3代按病毒感染复数分组转染.主要观察指标:①腺病毒载体的构建及鉴定.②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度.③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达.结果:①重组腺病毒的鉴定:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中顺利扩增出约400 bp大小的清晰条带,与预期相符;pMDl8-hIGF-1测序结果经Blast2.0比对与公布序列一致性99.9%(281位碱基同义突变,未影响氨基酸翻译:ggffggc-Gly);pAdtraek-CMV空载体和pAdtraek-MGF-1分别双酶切(Kpn Ⅰ和HindⅢ)鉴定正确.质粒pAdEasey-1和Ad-hIGF-1用Pac I酶切鉴定鉴定正确.证实病毒质粒同源重组成功.②荧光表达及滴度测定:重组质粒pAd-hIGF-1经Pac Ⅰ线性化后转化HEK293E细胞,48 h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达,72h表达最强.约5-7 d后细胞出现病毒感染的特征性CPE,由此计算出腺病毒滴度为3.0× 109 pfu/mL.⑨靶细胞的感染及表达效率:病毒转染骨髓问充质干细胞24 h后观察到绿色荧光的表达,72 h左右荧光达到最强.免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现.SDSPAGE电泳在7.8 KD附近出现明显条带,与实际人胰岛素样生长因子-1分子量7.6 kD相符,证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达.结论:本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hlGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-MGF-1,免疫细胞化学和Western Blot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达.     

miR-802对叉头框转录因子M1抑制A549/DDP细胞顺铂耐药性的靶向调控作用

目的探讨miR-802抑制非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性及其对叉头框转录因子M1(forkhead box protein M1, FoxM1)的靶向调控作用。方法 A549、A549/DDP细胞采用反转录PCR法检测miR-802相对表达量。将A549/DDP细胞分为空白转染组和miR-802过表达组(过表达组),分别转染miR-NC和miR-802类似物(miR-802 mimics),转染24、48、72、96 h后,采用反转录PCR法检测2组细胞miR-802相对表达量,并采用CCK-8法检测2组细胞增殖率;转染48 h后,CCK-8法检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性,采用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率和细胞周期,采用Western blot法检测转染后A549/DDP细胞内FoxM1蛋白相对表达量。结果 A549/DDP细胞miR-802相对表达量(0.21±0.03)低于A549细胞(0.85±0.12)(P<0.05);转染24、48、72、96 h,过表达组细胞miR-802相对表达量依次增高(P<0.05),且均高于空白转染组(P<0.05);转染48、72、96 h,空白转染组细胞增殖率依次增高(P<0.05),且均高于过表达组(P<0.05);转染48 h,过表达组细胞半数抑制浓度[(35.28±2.17)mg/L]和细胞早期凋亡率[(17.2±1.1)%]均高于空白转染组[(14.22±1.28)mg/L、(9.0±0.8)%](P<0.05),S期和G2/M期细胞比率[(21.30±0.20)%、(8.35±0.33)%]及细胞内FoxM1蛋白相对表达量(0.21±0.04)均低于空白转染组[(27.54±0.52)%、(14.67±0.70)%、0.44±0.06](P<0.05)。结论 miR-802可能通过抑制FoxM1表达而降低非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h,Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

大鼠缝隙连接蛋白Connexin 43的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建缝隙连接蛋白connexin 43(CX43)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行基因治疗研究奠定基础。方法:合成CX43发夹样shRNA的DNA单链一对和对照单链scramble一对,退火后将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的穿梭质粒pAd shRNA/H1,得到pAd shRNA/H1-CX43和pAd shRNA/H1-scramble。分别酶切及DNA测序鉴定后,经Pme I线性化后转化入BJ5187-AD-1感受态细菌,在细菌内进行同源重组构建含目的基因的重组腺病毒质粒载体。用Pac I酶切鉴定重组菌。将Pac I酶切重组的两种腺病毒质粒载体后,经脂质体转化293细胞进行包装得到重组的腺病毒颗粒,并通过293细胞绿色荧光表达反应重组腺病毒表达情况。将重组的腺病毒Ad-Cx43 shRNA和对照病毒Ad-scramble shRNA分别感染大鼠原代培养的星形胶质细胞,并检测星形胶质细胞CX43的表达。结果:证实穿梭质粒的以及重组腺病毒质粒均构建正确,腺病毒质粒转染293细胞后48 h即可见绿色荧光蛋白表达,10 d后全部细胞表达绿色荧光,并有半数细胞飘起,收获病毒感染培养星形胶质细胞后48 h,均有绿色荧光表达,经感染Ad-Cx43 shRNA的星形胶质细胞CX43的表达明显低于感染对照病毒Ad-scramble shRNA的星形胶质细胞。结论:成功构建表达大鼠CX43特异性发夹状shRNA的重组腺病毒载体,将为应用基因沉默技术研究CX43在神经系统疾病尤其是缺血性脑损伤中的作用提供依据。     

重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在小鼠成肌细胞中的表达

目的:构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体(AdBMP7),并观察其在小鼠成肌细胞C2C12细胞中的表达情况。方法:实验于2004-05/10在北京大学医学部完成。RT-PCR方法从HKE293细胞中克隆出hBMP7cDNA并亚克隆入穿梭质粒pAdtrackcmv中,构建pAdtrackcmv-hBMP7质粒。该质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组后挑选阳性重组体pAd-hBMP7质粒。线性化pAd-hBMP7质粒转染293A细胞后检测病毒噬斑形成情况,并于转染后9d收获病毒,大量扩增并制备高纯度、高滴度的AdBMP7。将AdBMP7按MOI=100来感染C2C12细胞,48h后分别应用RT-PCR和免疫组化方法来检测hBMP7在mRNA和蛋白水平的表达。结果:成功克隆出hBMP7cDNA,酶切鉴定pAdtrackcmv-hBMP7和pAd-hBMP7质粒正确重组,获得纯化后滴度达到5×1012vp/mL的AdBMP7。AdBMP7能有效感染C2C12细胞并表达hBMP7蛋白。结论:应用AdEasy-1腺病毒载体系统可在短期内制备高滴度的携带GFP和hBMP7的重组腺病毒AdBMP7,并在为进一步研究BMP7基因治疗促进骨愈合打下基础。     

miR-133a-3p高表达对ZIKV复制的影响及其潜在机制

目的探究寨卡病毒(ZIKV)感染A549细胞后诱导的小分子非编码RNA-133a-3p(miR-133a-3p)对ZIKV复制的影响及其潜在机制。方法在1×10~5/mL腺癌人类肺泡基底上皮细胞系A549中感染ZIKV,感染复数(MOI)为0.5,感染后在不同时间点收取RNA样品,以荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-133a-3p相对表达变化;同时在1×10~5/mL的A549中,转染3μL的miR-133a-3p模拟物(miR-133a-3p mimic)使miR-133a-3p高表达,转染后24 h,接种MOI=0.5的ZIKV或用终浓度为100μg/L的polyⅠ∶C处理细胞,感染后48 h收取细胞RNA或蛋白样品,通过RT-qPCR和蛋白质印迹法(Western blots)检测ZIKV的RNA的复制水平及宿主抗病毒先天免疫相关基因表达水平;将1μg含干扰素刺激应答元件(ISRE)的萤火虫荧光报告质粒(ISRE-luc)和50 ng海肾荧光报告质粒(pRL-TK)与3μL的miR-133a-3p共转入1×10~5/mL的A549中,转染后24 h,接种MOI=0.5的ZIKV或用终浓度为100μg/L的polyⅠ∶C处理细胞,在处理48 h后通过双荧光报告实验检测含ISRE序列的萤火虫荧光蛋白表达情况。结果 ZIKV感染可影响A549细胞内miR-133a-3p表达,相对于0 h,在8、16、24、36、48和72 h,miR-133a-3p值分别为:0.45±0.048、0.4±0.084、0.52±0.004、0.82±0.229、1.41±0.167、2.86±0.219; miR-133a-3p过表达使miR-133a-3p mimic组的ZIKV NS5 RNA相对于mimic control组值为:0.335 5±0.031,使IFN-α/β、ISG15、IFIT1(按图A→H的顺序)相对值为:3.46±1.105、1.329±0.198、2.723±0.966、1.48±0.059 5、3.3±0.4、2.83±0.442、5.79±0.277、1.98±0.362、5.96±0.796、5.94±1.007、7.07±0.111 5、5.96±0.795 7、5.96±0.796、7.16±0.42、2.2±0.491、1.92±0.189。结论 ZIKV感染A549细胞影响miR-133a-3p表达;miR-133a-3p过表达抑制ZIKV复制并激活Jak/STAT信号通路。     

慢病毒介导的小RNA干扰组织蛋白酶B转染小鼠脑微血管内皮细胞的条件

目的 研究慢病毒介导下小RNA干扰组织蛋白酶B转染小鼠脑微血管内皮细胞( bEND.3)的最佳条件.方法 实验分3组,完全培养基组(NP组)、培养基±5 mg/L凝聚胺组(P1组)和培养基+8 mg/L凝聚胺组(P2组),每组均有5个不同梯度的转染复数(MOI),即1、5、10、15、20,每个MOI值设3个孔,共45组.转染48、72、96 h分别在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白,并求其转染率,从而得到其最佳MOI值;1周后采用MTT法检测最佳MOI值对bEND.3活性和存活率的影响.结果 转染48 h时,在各组观察到少量绿色荧光蛋白,其转染率介于1％ ～9％;72 h和96 h时,MOI相同的各组间差异无统计学意义(P＞0.01),其中,MOI为1、5、15的各组转染率均低于20％;MOI为10和20组,转染率介于71％～97％与60％～ 84％,且MOI为10组转染率高于MOI为20组,差异有统计学意义(P＜0.01).MTT检测P1组和P2组存活率,1周时分别为(81.38 ±6.69)％、(62.03±5.13)％,P1组显著高于P2组(t=15.795,P＜0.001).结论 慢病毒介导的小RNA干扰组织蛋白酶B转染bEND.3最佳优化条件为MOI=10,凝聚胺为5 mg/L,最佳转染时间为转染后72 h.     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞

背景：对牙髓干细胞进行稳定高效安全的体外标记是示踪技术中首先需要解决的问题,也是牙齿再生体内研究的基础。 目的：探讨慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件及方法,并确定其转染后是否保持干细胞特性。 方法：通过改良酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,对其免疫表型及分化潜能进行鉴定,以感染复数为5,10,25,50和100的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白作用24 h和48 h,倒置显微镜下检测转染率和荧光强度,并对大鼠牙髓干细胞感染前后的克隆增殖能力、细胞周期及牙向分化能力进行比较,评价感染对其生物学特性的影响。 结果与结论：流式细胞仪检测结果显示大鼠牙髓干细胞STRO-1和CD146表达阳性,CD34和CD45表达阴性,经相应诱导培养后可向成骨和成脂分化。当感染复数为50,作用时间为48 h时,转染效率最高,荧光表达最强;感染前后细胞增殖、克隆形成率及细胞周期等方面差异无显著性意义（P＞0.05）,碱性磷酸酶阳性表达。说明感染复数为50作用48 h是慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件,且不影响牙髓干细胞生物学特性,为大鼠牙髓干细胞的体内研究提供了可靠的示踪方法。     

携带TRAIL的溶瘤腺病毒治疗三阴性乳腺癌的研究

目的：构建携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）基因的溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL,评估该病毒在体外和体内对三阴性乳腺癌的杀伤能力.方法：将质粒p55-hTERT-HRE与pPE3-TRAIL通过Lipofectamine 2000共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL;采用病毒体外增殖实验观察乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人正常乳腺细胞株MCF-10A中的增殖情况;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法比较不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）的病毒对两种细胞的抑制效应;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测病毒感染细胞后上清液中TRAIL的含量,采用蛋白质印迹（Western blotting）法检测细胞内TRAIL蛋白的表达.建立三阴性乳腺癌的原位成瘤模型及左心室注射模拟转移瘤裸鼠模型,应用“活体内光学成像系统”动态观察肿瘤的生长及转移情况.结果：p55-hTERT-HRE-TRAIL感染乳腺癌细胞株后表现出强大的增殖、复制能力,而在人正常乳腺细胞株内增殖并不明显;很低浓度的p55-hTERT-HRE TRAIL就对乳腺癌细胞产生明显的杀伤效应,而对正常乳腺细胞没有明显的杀伤作用;p55-hTERT-HRE-TRAIL感染乳腺癌细胞后,TRAIL蛋白的表达明显增多,而感染正常乳腺细胞后表达的TRAIL维持在较低的水平.乳腺癌原位成瘤模型中,空白对照组的光子数多于其他各组,肿瘤体积大于其他各组（P＜0.05）.左心室注射模拟转移瘤模型中,对照组活体内光学成像与TRAIL治疗组差异有统计学意义,TRAIL治疗组的生存天数延长（P＜0.05）.结论：成功构建高滴度的溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL,该病毒在乳腺癌细胞中具有特异性增殖并杀伤肿瘤细胞的能力.     

携带Pdcd5基因的三调控增殖性腺病毒的构建及鉴定

本研究旨在构建一种表达pdcd5基因的三调控增殖性腺病毒。应用DNA重组技术将pdcd5cDNA插入三调控条件增殖性腺病毒SG600的E3区,SG600病毒系统是运用人端粒酶反转录酶基因启动子（hTERTp）和缺氧反应元件（HRE）分别调控病毒复制必须基因E1a和E1b的表达,去除E1a基因CR2区中24个核苷酸而构建成的靶向肿瘤细胞增殖的病毒系统。采用酶切及PCR鉴定并筛选重组成功的质粒。荧光显微镜下观察带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组腺病毒SG611—EGFP对白血病细胞系的感染效率。实时定量PCR检测感染重组腺病毒SG611．pdcd5的K562细胞pdcd5的表达水平。结果显示,构建的se611-pdcd5病毒能扩增出hTERTp、HRE、pd—cd5基因以及腺病毒骨架和11型纤突结基因序列。SG611-EGFP对白血病细胞系K562和MEG-01的感染效率均能达到70％以上。感染SG611-pdcd5的K562细胞pdcd5的表达水平较SG611空载体和携带pdcd5的非增殖性腺病毒（Ad-pdcd5）明显增加（P〈0．001）,其表达水平随感染复数增加而升高。结论：成功构建了三调控增殖性腺病毒SG611-pdcd5,后者能高效感染白血病细胞系并高效表达pdcd5,为进一步运用pdcd5靶向肿瘤细胞进行基因治疗的研究提供了基础。     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平最高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.     

腺相关病毒2／1型载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究探讨重组腺相关病毒2／1型（recombinantadeno—associatedvirus2／1,rAAV2／1）作为载体在不同转染复数、不同时间点转染大鼠骨髓间充质干细胞（bonemalTOWmesenchymalstemcells,BMMSC）的效率及对其生长的影响。用含有增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）报告基因的rAAV2／1（rAAV2／1-EGFP）,以感染复数（multiplicityofinfection,MOI）分别为1×10^4、1×10^5、1×10^6转染体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,在3、7、14天时荧光显微镜下观察EGFP的表达,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况．以评估rAAV2／1对BMMSC存活、增殖、分化能力的影响。应用流式细胞仪检测rAAV2／1-EGFP对BMMsC的转染效率及荧光指数（fluorescenceindexnumber,FU。结果表明：转染24小时后即可观察到BMMSC发出的绿色荧光,荧光强弱不一,随着时间的延长,荧光的强度逐渐增强,7天后达到稳定的状态;在3、7、14天时不同MOIrAAV2／1-EGFP转染BMMSC的活力、增殖倍数、分化能力无明显变化（P〉0．05）;在同一感染复数时,7天比3天和14天比7天的增殖倍数显著增强（P〈0．01）。流式细胞仪检测显示,rAAV2／1-EGFP转染BMMSC的转染率和荧光指数随着MOI增加（1×10^4、1×10^5、1×10^6）和培养时间（3、7、14天）的延长而有不同程度的增加（P〈0．05）。结论：rAAV2／1-EGFP能有效地转染BMMSC,随转染复数的增加和短期内随转染时间的延长,转染率和荧光指数明显增加。在转染过程中rAAV2／1-EGFP对细胞的活力、生长无影响。对于改造BMMSC,rAAV2／1是一种有效的基因转移载体。     

脂肪组织来源干细胞可促进脂肪移植物的存活率

背景:在体外定向诱导条件下,脂肪组织来源干细胞可分泌细胞因子促进血管形成。目的:将脂肪组织来源干细胞和游离脂肪组织混合移植,评价脂肪组织来源干细胞对脂肪移植物存活率的影响。方法:采用不同感染复数MOI值Ad-EGFP基因转染人脂肪组织来源干细胞,确定理想的MOI值对细胞进行标记后,与人脂肪组织混合移植于裸鼠背部(实验组),以移植单纯脂肪组织为对照组。结果与结论:①脂肪组织来源干细胞转染24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度最强,传代后仍有强荧光表达。MOI值为50时转染率95.3%较为理想。②移植后6个月实验组脂肪组织来源干细胞散在分布于部分脂肪细胞及小叶间隔中,在体内能够部分转化为血管内皮细胞,移植脂肪湿质量与存活率高于对照组(P=0.001),移植脂肪纤维化及坏死程度低于对照组(P=0.001)。说明脂肪组织来源干细胞移植在体内可促进游离移植脂肪组织的再血管化,提高移植脂肪组织存活率。     

Efficient repetitive gene delivery to skeletal muscle using recombinant adenovirus vector containing the Coxsackievirus and adenovirus receptor cDNA

To improve adenovirus-mediated gene delivery to skeletal muscle, we have used a recombinant adenovirus vector encoding the human Coxsackievirus and adenovirus receptor (hCAR). Because CAR is expressed at a lower level in rodent myoblasts and muscle fibers than in other tissues, we expected that elevated expression of CAR in skeletal muscle would improve the efficacy of adenovirus-mediated gene transfer. Since the mouse myoblasts, C2C12 cells, showed low sensitivity to infection by recombinant adenovirus 5, we initially infected these cells at a high multiplicity of infection (MOI) of 250 with the recombinant adenovirus containing hCAR cDNA and LacZ gene. Subsequent infection by recombinant adenovirus containing the marker gene, green fluorescence protein, became efficient even at a low MOI of 25. Thus, elevated hCAR expression in mouse muscle fibers made a second virus inoculation at low doses possible. We also demonstrated that the elevated hCAR expression did not influence muscle membrane integrity. Our results suggest that co-expression of CAR and a therapeutic gene by adenovirus vector constitutes a novel strategy to advance gene therapy for hereditary muscle diseases.     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72h表达最强,感染率达80%,96h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。