重组腺病毒ADV-TK对肝癌抑制作用的实验研究

目的观察已构建的含胸苷激酶（TK）自杀基因的重组腺病毒（ADV-TK）对肝癌细胞的体外杀伤作用和对肝癌裸鼠移植瘤的治疗效果。方法将ADV-TK体外感染人肝癌细胞株SMMC-7721,噻唑蓝（MTT）法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度更昔洛韦（GCV）作用后的细胞存活率情况。构建肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤注射重组腺病毒ADV-TK结合GCV治疗移植瘤的变化。结果相同滴度的重组腺病毒与不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后,MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低。动物实验中ADV-TK治疗组肿瘤体积明显小于对照组（ADV-null及NS）（P〈0.01）。结论重组腺病毒ADV-TK对肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。     

表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的条件增殖型溶瘤腺病毒的构建

目的构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因的条件增殖型溶瘤腺病毒pPE3-SEA。方法将已构建好的携带SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒载体质粒pDC318-SEA经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后,将酶切下的超抗原SEA基因片段连接到同样经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后的增殖型溶瘤腺病毒穿梭质粒pENTR12中,将鉴定正确的携带SEA基因增殖溶瘤腺病毒载体命名为pENTR12-SEA。增殖溶瘤腺病毒载体pENTR12-SEA与病毒骨架质粒pPE3-ccdB重组,通过Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒pPE3-SEA。结果应用PCR验证、双酶切分析、序列测定表明,成功构建了携带SEA基因增殖型溶瘤腺病毒载体pENTR12-SEA,通过同源重组成功获得携带超抗原SEA基因片段的pPE3-SEA增殖型溶瘤腺病毒,且病毒滴度为2.5×1010pfu/ml。结论成功构建了表达超抗原SEA基因的条件增殖型溶瘤腺病毒pPE3-SEA,为以后进一步研究该病毒对肿瘤靶向治疗的作用提供了实验基础。     

癌症靶向治疗研究的新进展

传统的化疗既攻击癌细胞也攻击人体的正常细胞，而靶向药物只对特定癌细胞产生作用，而对正常细胞的影响较少。其中，对肿瘤具有特异性杀伤作用的溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）就是被广泛关注的热点之一。     

表阿霉素和阿霉素对原代乳腺癌的体外敏感性研究

目的 了解表阿霉素和阿霉素在体外对乳腺癌、癌旁组织和正常乳腺组织的杀伤作用。方法 取得不同患者的乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织标本，采用胶原酶消化法获取乳腺原代细胞，应用原代体外培养和MTT法检测化疗药物在不同浓度下对乳腺原代细胞的杀伤率。结果 在1倍PPC（血药浓度）时表阿霉素对乳腺癌原代细胞的体外肿瘤杀伤作用强于阿霉素（P〈0．01）；对正常的乳腺原代细胞，表阿霉素和阿霉素的体外杀伤作用明显下降（P〈0．01），而且表阿霉素弱于阿霉素（P〈0．01）。结论 对于原发乳腺癌患者，表阿霉素不但治疗效果优于阿霉素，而且对肿瘤组织具有更高的选择性，可以作为乳腺癌治疗的一线药物。     

hTERT启动子调控p53基因表达逆转录病毒的抗肿瘤作用

目的：观察人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子驱动野生型p53的新型逆转录病毒对肿瘤的杀伤作用。方法：先将前期构建的逆转录病毒穿梭质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53进行包装，通过浓缩获得高滴度病毒液。然后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53感染包含突变型p53的大肠癌细胞系SW620，通过RT-PCR和Western blot证实p53mRNA和p53蛋白的表达。最后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53和pLHCX-hTERT-EGFP感染hTERT阳性的人大肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549和hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5，观察其特异性杀伤作用；另外通过裸鼠皮下注射肿瘤细胞SW620和A549，建立肿瘤模型，应用逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后测量肿瘤体积计算肿瘤生长抑制率。结果：获得病毒液的滴度分别为2.3×10^7CFU·mL^-1和3.5×10^7CFU·mL^-1。逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53经RT-PCR证实p53mRNA的表达，经Western blot检测到p53蛋白表达。重组逆转录病毒导入外源的野生型p53基因后，通过流式细胞检测到hTERT阳性人大肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549凋亡率远高于hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5（P〈0.05）。体内实验证实各组通过逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后的肿瘤体积明显小于对照组（P〈0.05）。结论：获得的新型逆转录病毒对肿瘤有特异性的杀伤作用。     

超声内镜引导下溶瘤病毒植入治疗晚期胰腺癌的护理

胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,晚期胰腺癌预后极差,治疗手段匮乏,至今人们仍在不断探寻新的介入治疗手段,期望延长患者的生存期。溶瘤病毒作为一类能在肿瘤细胞中特异性增殖、复制的病毒,能通过自身在肿瘤细胞中的复制来杀死并裂解肿瘤细胞,表现出其抗肿瘤作用同时溶瘤病毒对正常细胞无杀伤作用。于是,近年来超声内镜（endoscopic ultrasonography,EUS）介导溶瘤病毒植入晚期胰腺癌组织的治疗进入临床探索研究,我科进行了国内首例EUS引导溶瘤病毒植人治疗晚期胰腺癌的尝试,并累计于2007年5—12月共行植入治疗6例,现将护理措施报道如下。     

重组PEDF腺病毒载体的构建及其抗膀胱癌效应的研究

目的 利用腺病毒载体系统构建视网膜色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)的重组腺病毒载体,并观察其对膀胱癌细胞J82 的杀伤作用.方法 将PEDF cDNA 克隆入pENTR-TOPO中,通过同源重组接入腺病毒载体,用脂质体转染入人胚肾293细胞中,包装获得重组腺病毒Ad-PEDF.将重组腺病毒颗粒体外感染J82细胞后,检测细胞活力和细胞凋亡,并在软琼脂中测定克隆形成能力.将感染装有PEDF 基因的病毒的J82细胞注入裸鼠皮下,观察PEDF 的抑瘤能力.结果 免疫印迹法(Western blot)证实感染PEDF 腺病毒的J82细胞中有PEDF 蛋白的正确表达.将重组腺病毒颗粒体外感染J82,能以剂量依赖的方式抑制细胞活力;流式细胞术检测凋亡细胞明显多于对照组;软琼脂试验显示感染PEDF后能抑制克隆的形成. 感染PEDF腺病毒的膀胱癌细胞在裸鼠皮下形成的种植瘤的体积与感染对照病毒的种植瘤相比有显著减小.结论 PEDF 能抑制膀胱癌细胞的生长,具有潜在的治疗作用.     

恶性肿瘤患者外周血CIK细胞体外增殖能力及其杀伤活性

[目的]研究恶性肿瘤患者外周血自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)体外增殖情况及杀伤活性,为肿瘤自体CIK细胞治疗提供实验依据.[方法]从恶性肿瘤患者的外周血中分离出CIK细胞进行体外培养,使用细胞计数板计数不同时间点CIK细胞的数目及MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀伤活性.[结果]低年龄组较高年龄组CIK细胞体外增殖及杀伤活性强( P ＜0.01),不同分期的肿瘤患者CIK细胞体外增殖能力及杀伤活性均较强,不同分期之间无显著性差异( P ＞0.05);不同性别的恶性肿瘤患者CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性无明显差别( P ＞0.1).恶性肿瘤患者的CIK细胞在体外对不同肿瘤细胞均具有较强的杀伤活性,对人乳腺癌细胞(MCF-7),肺癌细胞株(SC-1680),前列腺癌细胞株(PC-3),宫颈癌细胞株(Hela)的体外杀伤活性均超过50%.[结论]患者年龄是影响其外周血CIK细胞体外增殖能力及杀伤活性的重要因素,而肿瘤分期、患者性别对CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性无明显影响;CIK细胞具有较广的抗肿瘤细胞的特点.     

重组人p53腺病毒治疗脊柱转移瘤的近期疗效观察

目的探讨重组人p53腺病毒（recombinant human p53 adenovirus,rAd-p53）在脊柱转移瘤的治疗中的近期疗效。方法 2006年6月2009年8月,以经皮注射rAd-p53联合放疗及单独放疗方法治疗肺鳞状细胞癌来源脊柱转移瘤患者各18例,通过比较两组治疗前后的肿瘤体积变化评价疗效,观察两组治疗后肿瘤细胞坏死率情况,检测P53蛋白在癌组织中的表达以及血清中抗特异p53基因腺病毒抗体水平。结果联合治疗组疗效评定有效率为66.7%,高于单独放疗组的27.8%,差异有统计学意义（P〈0.05）。联合治疗组可见明显肿瘤细胞坏死、P53蛋白表达阳性及血清中抗特异p53基因腺病毒抗体水平强阳性。结论 rAd-p53基因治疗能抑制肿瘤生长,联合放疗可弥补单一放疗的不足,提高放疗的敏感性,有效治疗脊柱转移瘤。     

CDK2-AP1通过调控细胞周期抑制乳腺癌生长

目的：探讨CDK2-AP1在乳腺癌的作用及其机制。方法分别在正常乳腺组织及不同分期乳腺癌组织中检测CDK2-AP1的表达情况;进行CDK2-AP1的LOF & GOF细胞功能实验;接种CDK2-AP1干扰或过表达的乳腺癌细胞及对照细胞在裸鼠观察成瘤及相应指标。结果在乳腺癌存在CDK2-AP1表达降低/缺失而CDK2/CyclinD1表达升高的情况,且CDK2-AP1的表达在正常乳腺组织细胞、乳腺导管原位癌、侵袭性乳腺癌、复发转移性乳腺癌渐次降低（P<0.001）,与CDK2/CyclinD1相反。体内、外实验均发现抑制CDK2-AP1表达后乳腺癌细胞周期后移、增殖加快;过表达CDK2-AP1的乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1和G2/M期,生长受抑制、裸鼠成瘤速度及大小均受抑制。结论 CDK2-AP1的表达降低以至缺失促进乳腺细胞进入恶性增殖形成肿瘤,缺乏细胞周期负性调控的乳腺癌细胞增殖能力增强。     

A tumor-targeted and conditionally replicating oncolytic adenovirus vector expressing TRAIL for treatment of liver metastases.

We have constructed a new capsid-modified adenovirus (Ad) vector that specifically replicates in tumor cells and expresses TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). The Ad capsid contains short-shafted fibers derived from Ad serotype 35, which allow for efficient infection of malignant tumor cells, and largely avoids innate toxicity after intravenous application. Replication-dependent homologous recombination in Ad genomes was used to achieve tumor-specific expression of Ad E1a (to mediate viral replication) and TRAIL (to mediate apoptosis and enhance release of progeny virus from infected cells). We demonstrated that our oncolytic vector (Ad5/35.IR-E1A/TRAIL) induced apoptosis in human tumor cell lines derived from colorectal, lung, prostate, and liver cancer. Both in vitro and in vivo tumor models showed efficient intratumoral spread of this vector. In a model for metastatic colon cancer, tail vein infusion of Ad5/35.IR-E1A/TRAIL resulted in elimination of preestablished liver metastases. Intravenous injection of this vector caused a transient elevation of serum glutamic pyruvic transaminase in tumor-bearing mice, which we attributed to factors released from apoptotic tumor cells. Liver histology analyzed at day 14 after virus injection did not show signs of hepatocellular damage. This new oncolytic vector represents a potentially efficient means for gene therapy of metastatic cancer.     

Oncolytic adenovirus-mediated shRNA against Apollon inhibits tumor cell growth and enhances antitumor effect of 5-fluorouracil

Apollon, a membrane-associated inhibitor of apoptosis protein, protects cells against apoptosis and is upregulated in certain tumor cells. In this study, the effects of Apollon protein knockdown by RNA interference on the growth of human HeLa, HT-1080 and MCF-7 cells in vitro and in vivo were investigated. An oncolytic adenovirus (ZD55) containing the RNA polymerase III-dependent U6 promoter to express short hairpin RNA (shRNA) directed against Apollon (ZD55-siApollon) was constructed. Our data show that ZD55-siApollon successfully exerts a gene knockdown effect and causes the inhibition of tumor cell growth both in culture and in athymic mice in vivo. Cell cycle analysis, 4',6-diamidino-2-phenylindole staining and western blot analysis reveal that ZD55-siApollon-mediated suppression of Apollon induces apoptosis. Intratumoral injection of ZD55-siApollon significantly inhibits tumor growth in HT-1080 xenograft mice. Furthermore, ZD55-siApollon enhances the antitumor effect of 5-fluorouracil, a chemotherapeutic agent. In conclusion, these results suggest that the depletion of Apollon by oncolytic adenovirus-shRNA delivery system provides a promising method for cancer therapy.     

雌激素饥饿增强TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡

目的：探讨雌激素饥饿对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响及作用机制。方法：MCF-7细胞培养贴壁之后,用雌激素饥饿处理后加入TRAIL,用荧光染料Hoechst染色法检测细胞的凋亡,用细胞计数法检测细胞的存活。在雌激素饥饿处理MCF-7细胞后,收集对照和饥饿组蛋白用Westernblot法检测相关的蛋白表达。结果：单独使用雌激素饥饿处理或者单独使用TRAIL处理乳腺癌细胞MCF-7都能诱导细胞凋亡,但是它们诱导凋亡的活性较小,两种方法联合使用可以极大地增加诱导细胞凋亡的活性（P〈0.001）。雌激素饥饿处理后的乳腺癌细胞,死亡受体5（DR5）表达上调。结论：乳腺癌细胞MCF-7对TRAIL敏感度不高,雌激素饥饿可以增加TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的活性,DR5与雌激素饥饿诱导TRAIL活性增加相关。     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。方法：利用Lipofectamine2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义（P〉0.05）。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

TRAIL联合Res对乳腺癌MDA-MB-231细胞DR和Caspase表达的影响

目的研究TRAIL联合白藜芦醇（Res）对乳腺癌MDA-MB-231细胞DR和caspase表达的影响。方法MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞表面DR4、DR5蛋白的表达;分光光度法检测caspase-3、caspase-8相对活性;荧光定量PCR检测DR4、DR5及caspase-3、caspase-8 mRNA的表达。结果50μmol／L和100μmo/L,Res分别与50ng／mL TRAIL联合作用后,对MDA-MB-231细胞增殖的抑制率及细胞凋亡率分别与单独应用相应浓度的Res和TRAIL比较,均存在显著差异（P〈0．01）。50μmol／L和100μmol／LRes分别与50ng／mLT RAIL联合作用后,caspase-3、caspase-8的相对活性与对照组及单用TRAIL、Res比较均明显增强,差异显著（P〈0．01）。Res作用后,细胞表面DR4、DR5荧光指数与对照组比较明显增强。荧光定量PCR结果显示与对照组比较．Res作用后DR4、DR5mRNA表达上调;与单独用药比较,TRAIL联合Resetcagpase-3、easpase-8 mRNA表达上调。结论TRAIL和Res联合应用对诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡具有明显的协同效果,其作用机制可能与增加DR和caspase活性有关。     

半乳糖基壳聚糖5氟尿嘧啶纳米粒的制备及其抑制小鼠结肠癌的实验研究

目的:半乳糖基壳聚糖纳米材料与5-氟尿嘧啶(5-FU)合成5-FU纳米粒,并观察其在体内抑制小鼠结肠癌的疗效.方法:将体外培养的C26细胞接种小鼠肝左叶,成瘤后,分别用0.9％氯化钠液、空纳米粒、5-FU和5-FU纳米粒行尾静脉注射,观察5-FU纳米粒的抗肿瘤效果.用酶联免疫吸附试验法检测血清γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)含量,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定小鼠脾自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞(CTL细胞)活性.结果:与0.9％氯化钠液组及纳米粒组相比,5-FU组和5-FU纳米粒组的瘤质量显著降低(P＜0.01),尤其5-FU纳米粒组降低更显著(P＜0.01).与其他各组比较,5-FU组小鼠,外周血IFN-γ和IL-2含量均显著降低(P＜0.01),5-FU纳米粒组与0.9％氯化钠液组比较差异无统计学意义(P＞0.05).5-FU组的脾NK细胞和CTL细胞杀伤活性较其他各组显著降低(P＜0.01),5-FU纳米粒组与0.9％氯化钠液组比较未见降低(P＞0.05),纳米粒组NK和CTL杀伤活性0.9％氯化钠液组增高(P＜0.05).结论:5-FU纳米粒治疗结肠癌模型,具有明显抗肿瘤效应,纳米粒材料具有提高机体免疫功能,减低5-FU对机体免疫的抑制作用.     

Replicative oncolytic adenoviruses in multimodal cancer regimens

The use of replication-competent viruses that have a cytolytic cycle has emerged as a viable strategy (oncolytic virotherapy) to specifically kill tumor cells and the field has advanced to the point of clinical trials. A theoretical advantage of replicative oncolytic viruses is that their numbers should increase via viral replication within infected tumor cells and resulting viral progeny can then infect additional cells within the tumor mass. The life cycle of a virus involves multiple interactions between viral and cellular proteins/genes, which maximize the ability of the virus to infect and replicate within cells. Understanding such interactions has led to the design of numerous genetically engineered adenovirus (Ad) vectors that selectively kill tumor cells while sparing normal cells. These viruses have also been modified to function as therapeutic gene delivery vehicles, thus augmenting their anticancer capacity. In addition, the oncolytic mode of tumor killing differs from that of standard anticancer therapies, providing the possibility for synergistic interactions with other therapies in a multimodal antitumor approach. In this review, we describe the oncolytic Ad vectors tested in preclinical and clinical models and their use in combination with chemo-, radio-, and gene therapies.     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体联合顺铂对小鼠移植型肝癌抑制作用的研究

目的探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）联合顺铂（DDP）对小鼠移植型肝癌的抑制作用。方法 H22肝癌移植瘤小鼠随机分为生理盐水（对照）组、TRAIL组、TRAIL＋DDP组和DDP组,称取瘤重分析其抑瘤作用、流式细胞检测细胞凋亡率。结果 （1）与对照组相比,TRAIL、DDP对小鼠移植性肝癌生长均有明显的抑制作用（P〈0.01）,TRAIL与DDP联用有增效作用（P〈0.05）。TRAIL组、DDP组及TRAIL＋DDP组的抑瘤率分别为45.14%、57.98%和77.23%。（2）与单一用药组相比,TRAIL与DDP联用可明显提高肿瘤细胞的凋亡率。结论 TRAIL与DDP联用对小鼠H22肝癌移植瘤的生长具有协同抑制作用。     

Cancer targeting Gene-Viro-Therapy of liver carcinoma by dual-regulated oncolytic adenovirus armed with TRAIL gene

Liver cancer is a common and aggressive malignancy, but available treatment approaches remain suboptimal. Cancer targeting Gene-Viro-Therapy (CTGVT) has shown excellent anti-tumor effects in a preclinical study. CTGVT takes advantage of both gene therapy and virotherapy by incorporating an anti-tumor gene into an oncolytic virus vector. Potent anti-tumor activity is achieved by virus replication and exogenous expression of the anti-tumor gene. A dual-regulated oncolytic adenoviral vector designated Ad·AFP·E1A·E1B (Δ55) (Ad·AFP·D55 for short thereafter) was constructed by replacing the native viral E1A promoter with the simian virus 40 enhancer/α-fetoprotein (AFP) composite promoter (AFPep) based on an E1B-55K-deleted construct, ZD55. Ad·AFP·D55 showed specific replication and cytotoxicity in AFP-positive hepatoma cells. It also showed enhanced safety in normal cells when compared with the mono-regulated vector ZD55. To improve the anti-hepatoma activities of the virus, the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) gene was introduced into Ad·AFP·D55. Ad·AFP·D55-TRAIL exhibited remarkable anti-tumor activities in vitro and in vivo. Treatment with Ad·AFP·D55-TRAIL can induce both autophagy owing to the Ad·AFP·D55 vector and caspase-dependent apoptosis owing to the TRAIL protein. Therefore, Ad·AFP·D55-TRAIL could be a potential anti-hepatoma agent with anti-tumor activities due to AFP-specific replication and TRAIL-induced apoptosis.