人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

假单胞菌SP-6胞外弹性蛋白酶基因的克隆与表达

以分离筛选、鉴定的假单胞菌为研究材料,提取假单胞菌的基因组为模板基因,设计引物进行PCR扩增.扩增的条件为94℃预变性4min,98℃变性10 s,58℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环,72℃复性10min.用试剂盒回收PCR产物,以PGEM-T Easy Vector为载体,产生重组质粒,转化到大肠杆菌(E.coli)JM109细胞中,于LB平板上进行蓝白筛选阳性克隆.提取阳性克隆的质粒,电泳筛选滞后质粒,EcoRⅠ酶切验证后进行测序,检测弹性蛋白酶基因在JM109 E.coli细胞中的表达.结果表明PCR扩增出1.67 kb的基因片段,并成功克隆在E.coliJM109细胞中;挑取白斑提取的质粒,检测有滞后质粒,EcoR Ⅰ酶切检测到3.0 kb的载体和1.67 kb的基因片段;以滞后质粒为模板再次进行PCR扩增,扩增出1.67 kb基因片段,证明该质粒为重组质粒,经上海博亚生物技术公司测序为1.67 kb的基因片段,并在E.coliJM109细胞中表达.     

海洋放线菌乙酰CoA连接酶的克隆

克隆稀有海洋放线乙酰CoA连接酶合成基因的基因片段。根据Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守区设计两对乙酰CoA连接酶特异性引物,以其总DNA为模板,采用PCR的方法扩增得到了包含乙酰CoA连接酶的完整的基因片段,并将该片段成功插入到克隆载体pUC-18中。将重组质粒进行酶切验证并在检测机构中验证测序结果正确,成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的乙酰CoA连接酶合成基因的基因片段,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

转基因产品中常见外源基因的克隆与转化

设计带不同酶切位点的引物,分别用PCR扩增植物内源rbcL基因和2种转基因产品中常见的外源基因-CP4-EPSPS基因和BAR基因,并分别与pGEM-TEasyVector连接,克隆到大肠杆菌DH5α中。提取克隆菌落的质粒,并进行酶切鉴定和序列测定。对3个基因的克隆质粒进行相应的双酶切,回收酶切产物,先后转化到受体载体pCAMBW中。最后获得的重组质粒的酶切和PCR鉴定结果表明3个基因已被成功转化到受体载体中。     

沙门氏菌invA基因重组质粒标准的构建

目的 研制沙门氏菌invA基因重组质粒,为分子生物学方法快速检测沙门氏菌提供质粒标准。方法 通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,测序方法证实目的片段已成功重组,荧光定量PCR方法定性检测分析,采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法对标准质粒分子进行定值。结果 invA基因目的片段成功重组至pMD 18-T载体上,荧光定量PCR结果显示制备重组质粒标准为沙门氏菌核酸标准,重组质粒标准的浓度为2.9 μg/mL。结论 成功构建沙门氏菌invA基因重组质粒,为快速检测沙门氏菌奠定了基础。     

烟草侧芽生长相关基因克隆及RNAi载体的构建转化

为了培育打顶后不长侧芽的烟草植株,通过同源克隆,在烟草(品种K326)中得到了与侧芽生长相关基因的1个片断,将该片段序列通过BLAST检索Genbank同源比对,发现该基因同番茄的LS基因有非常高的同源序列,另外与水稻的MOC基因、拟南芥的LAS基因也有一定的同源性,命名为TLR基因.将TLR基因阅读框内640 bp的正向和反向片断构建到RNAi载体pHANNIBAL内含子两侧,再经NotI酶切回收约4300 bp目的片段,并插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含TLR基因片段正反向重复序列的植物表达载体pHANNIB AL-TLR-P ART27.将pHANNIB AL-TLR-P ART27质粒导入根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,没有得到转基因再生植株,推测这与TLR基因表达被抑制有关.     

cyt b基因在肉制品种属来源鉴定中的应用

目的:利用cyt b基因设计分子探针并用于肉制品种属来源的鉴定。方法:对多种肉制食品进行总DNA提取,并基于cyt b基因设计的引物进行PCR扩增目的基因片段,测定cyt b基因片段的PCR扩增产物序列,使用BLAST搜索软件将其序列与Gen Bank中的同源序列进行比对分析。结果:采用设计的cyt b基因引物对我国10大类共计27种肉制品进行DNA扩增,均得到清晰单一的目的基因片段;测序及序列比对结果显示实验采用的cyt b基因作为分子标记得到的碱基序列,可以准确的实现物种鉴定。结论:实验中对肉制品种属来源的鉴定方法准确、简单、高效,适用于检测机构对肉制品种属来源的快速鉴定,并能为食品监管部门判定肉制品掺假造假提供有力的技术支持和依据。     

多重PCR合成天蚕素基因及其在E.Coli中的克隆

天蚕素抗菌肤是食品领域中研究最多的昆虫抗菌多肤。通过对62种天蚕素低级结构的研究，设计出4条全新抗菌肤序列。应用多重PCR方法合成设计多肤的全基因序列，酶切PCR扩增产物和克隆载体puc19，构建重组质粒并将其转化到大肠杆菌中。测序结果表明目的片段已经成功克隆到宿主菌JM109中。     

应用DNA条形码技术鉴定烤鱼片、鱼干中河鲀鱼鱼种

应用DNA条形码技术对北京和厦门市市售烤鱼片、鱼干中河鲀鱼成分进行鉴定。方法 以烤鱼片、鱼干中提取基因组DNA为模板,利用针对河鲀鱼细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆并测定线粒体COⅠ基因序列。将测序结果与GenBank中已有河鲀鱼的DNA序列进行BLAST比对,并且构建分子进化树。结果 本研究27份样品中有15份能扩增出特异性条带。通过BLAST比对和进化树分析,将15份样品归属到不同的河鲀鱼鱼种中。结论 北京和厦门市市售烤鱼片和鱼干中存在混入河鲀鱼的现象,应加强监管和规范产品的加工程序以避免中毒事件发生。     

金褐链霉菌SYAU0709中AURJ3M基因的克隆和序列分析

以金褐链霉菌SYAU0709的DNA为模板,根据GenBank中公布的PimM的序列设计引物,通过PCR扩增方法从金褐链霉菌中扩增出约579bp的目的片段。将PCR产物克隆至PMD19-T Vector中,通过PCR扩增及测序分析发现,金褐链霉菌SYAU0709来源的AURJ3M基因和纳塔尔链霉菌PimM基因的序列具有95%的相似性。通过摇瓶发酵显示AURJ3M基因能促进金褐霉素的生物合成。     

HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。      

Construction of an autonomously replicating plasmid in n-alkane-assimilating yeast, Candida tropicalis

A transformation system using the autonomously replicating plasmid in the n-alkane-assimilating and asporogenic diploid yeast, Candida tropicalis, was developed. For the cloning of a DNA fragment containing a potential autonomously replicating sequence (ARS) from the genomic DNA of C. tropicalis, the ura3 mutant obtained using ethylmethane sulfonate as the host and the URA3 gene amplified by PCR using the C. tropicalis genomic DNA as a selectable marker were prepared. Comparison of ARSs among yeasts revealed that the consensus sequence found in S. cerevisiae was also present in C. tropicalis. The autonomously replicating plasmid containing the putative ARS as the shuttle vector, capable of replicating in both E. coli and C. tropicalis, was first constructed. The transformation system using this plasmid, in addition to the integrative transformation system, will be applicable to genetic studies of C. tropicalis.     

Polymerase chain reaction assay for detection of sheep and goat meats

Polymerase Chain Reaction (PCR) was applied to a qualitative differentiation between sheep, goat and bovine meats. Oligonucleotide primers were designed for the amplification of sheep satellite I DNA sequence. The PCR amplified 374 bp fragments from sheep and goat DNA, but no fragment from bovine, water buffalo, sika deer, pig, horse, rabbit and chicken DNA. Sheep DNA (10 pg) was detected by 4% agarose gel electrophoresis following PCR amplification. Althoug cooking of the sample meats reduced the PCR products, sheep DNA was detected in the meat heated at 120°C. In order to differentiate between sheep and goat meats, nucleotide sequences of the PCR products were determined directly by cycle sequencing. The sequence of PCR products showed 92% of homology between sheep and goat. They were differentiated by ApaI digestion of the PCR products because sheep had one ApaI site and goat had no site in the PCR products.     

CODEHOP法设计引物克隆色盐杆菌ST307胆碱脱氢酶基因及其序列分析

目的研究色盐杆菌ST307甜菜碱的合成,克隆分析其胆碱脱氢酶betA基因片段。方法采用醇提法提取色盐杆菌ST307中的甜菜碱并检测,用CODEHOP在线程序设计简并引物扩增胆碱脱氢酶betA基因序列,并进行序列分析。结果色盐杆菌ST307细胞中积累甜菜碱,通过PCR获得长度为485 bp的betA基因片段。BLAST序列分析显示该基因序列与多个菌株的betA基因序列具有较高的同源性,最高达83%。核苷酸序列比对及进化树构建结果显示,色盐杆菌ST307胆碱脱氢酶基因序列与Pseudomonas fulva 12-X进化关系最为接近。结论 CODEHOP法设计的简并引物可信性较强,同时betA基因片段的成功克隆将为获得ST307胆碱脱氢酶基因的全序列、研究耐盐机制和遗传改良提供科学依据。     

人甲胎蛋白 AFP 在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在毕赤酵母中的转化

利用跨越内含子的PCR技术,从三角酵母(Trigonopsisvariabilis)中扩增得到D-氨基酸氧化酶基因(DAAO),通过TA克隆的方法将其克隆至pBS-T载体,并转化大肠杆菌TOP10。序列测定结果表明,所得DAAO基因的5’端内含子已被删除,基因总长度为1071bp。之后将该基因与酵母表达载体pPIC3.5K连接,转化巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。     

抗菌肽基因在E.Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70 bp的DNA片段,用"片段拼凑"的方法通过三步PCR扩增得到目的基因,天蚕素基因被克隆到PUC19载体上,再转化大肠杆菌JM109.电泳分析重组质粒,确定天蚕素基因已转化到JM109上.摇床发酵转化子,IPTG诱导表达目的肽,最后提纯表达产物.SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现,荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致,最后确定天蚕素在JM109中得到表达.抑菌圈活性实验表明,表达肽具有一定抗菌活性.     

香灰菌gpd启动子的克隆及功能验证

为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件。本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA database软件分析发现,gpd基因上游区域内不仅包含启动子所需的特征核心元件TATA-box、CAAT-box、G-box、GC-box、CT-rich等,还含有一个高分值的转录起始位点。为进一步验证该序列的启动子功能,将gpd启动子元件与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)和潮霉素基因(hph)连接构建成融合表达载体,通过根癌农杆菌介导将其转化香灰菌丝。潮霉素抗性筛选、绿色荧光蛋白检测结果显示,香灰菌gpd启动子成功驱动了潮霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白基因的表达,根癌农杆菌介导转化成功,为香灰菌外源基因表达及基因功能的研究奠定了基础。