常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的 建立4种转基因(genetically modified, GM)大米成分多重定量检测方法, 解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品的高通量精准定量难题。方法 采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析, 并将其转化为含量百分比。结果 转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好, 标准曲线r2值均在0.99以上, 定量相对灵敏度可达0.1%, 相对误差和相对标准偏差值均小于25%, 定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论 本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法, 解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点, 为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。     

转基因甜菜品系H7-1的数字PCR定量检测方法

为实现转基因甜菜品系H7-1的标识管理和精准定量,根据H7-1的5’边界序列和甜菜谷氨酰胺合成酶基因（glutamine synthetase,GS）设计引物和探针建立双重数字PCR检测体系。该方法的特异性、灵敏度、精密度和准确度均进行了测试。结果显示：建立的转基因甜菜H7-1数字PCR检测方法特异于H7-1品系检测,在20 μL反应体中H7-1品系特异性序列和内源基因GS的定量下限（limit of quantitation,LOQ）分别为3.1拷贝/μL和6.3拷贝/μL,检测下限（limit of detection,LOD）检出限分别为0.6拷贝/μL和1.3拷贝/μL,精密度和准确度在可接受范围内,该定量方法不依赖于标准曲线建立,可便捷的应用于转基因甜菜H7-1成分的精确定量检测。     

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。     

基于微滴式和芯片式数字PCR技术的转基因克螟稻成分的定量检测

以转基因克螟稻品系为研究对象,通过大米内源蔗糖磷酸合成酶基因和转基因克螟稻品系特异性序列的绝对拷贝数分析,建立转基因克螟稻成分的双重数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）定量分析方法。本研究中转基因克螟稻定量体系中最适DNA添加量在10 pg～13 ng之间,模板断裂程度、PCR扩增退火温度等因素对定量结果的影响不大。其定量的绝对灵敏度达1 copies/μL,可在微滴式和芯片式数字PCR平台上准确检测质量分数在0.1%～100%之间的转基因克螟稻成分,尤其是对低于1%的样品,其定量准确性高于传统的实时荧光PCR方法。本研究建立的转基因克螟稻成分定量分析方法适用性较好,可用于转基因水稻规范化与标准化的定量分析。     

实时荧光PCR技术快速检测奶制品中掺入的大米源性成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的奶制品中掺入大米源性成分的快速检测方法。方法:以水稻的根部表达基因(gos9)为靶基因设计特异性引物和探针,经特异性实验和灵敏度实验验证引物探针可行性,并经模拟含大米奶粉及市售奶类制品检测验证其实际检测能力。结果:该引物探针体系只针对大米DNA进行扩增,与奶类主成分牛、羊及其它谷类和植物性食物DNA均无交叉扩增;最低能检测到0.1ng的大米DNA,对含大米粉的模拟混合奶粉样品,检出限可达0.1%(W/W)。将其应用于21份市售奶制品样品检测,对含大米源性成分的奶制品扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:该实时荧光PCR检测体系具有快速、特异、灵敏的优点,可以准确鉴定出奶制品中大米成分,适用于奶类中掺加大米源性成分的检测。     

实时荧光PCR法鉴定食用淀粉植物来源

以红薯g3pdh基因、藕ITS1-5.8S-ITS2基因、山药rbcL基因和葛根CHI基因等设计红薯、藕、山药以及葛根特异性引物探针;结合文献报道的木薯、大米、小麦、玉米及马铃薯特异性引物探针,建立红薯、木薯、马铃薯、藕、山药、葛根、大米、玉米及小麦等9种常见食用淀粉的实时荧光PCR检测方法。该方法特异性强,绝对灵敏度0.01 ng/μL,相对灵敏度1%(质量分数)。对50份市售淀粉样品的检测表明,在红薯淀粉、马铃薯淀粉、藕粉及葛根粉等中均检出非标识的马铃薯、木薯或玉米等成分,标签错误标识率达32%。     

转基因大豆DAS44406-6多重荧光定量PCR检测方法的建立

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS44406-6品系的5'端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立同时检测转基因大豆DAS44406-6品系和大豆内源基因Lectin的多重荧光定量PCR方法,并运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行特异性评价,并分析该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;重复性实验表明DAS81419品系4种含量、9次重复反应Ct值的标准偏差介于0.050~0.222,相对标准偏差介于0.169%~0.677%,均在可接受范围内。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS44406-6的快速、准确的检测。     

多重串联式PCR基因碟片技术检测转基因大豆GTS 40-3-2

建立多重串联式PCR(MT-PCR)的基因碟片技术用于转基因大豆GTS40-3-2的检测。针对GTS 40-3-2的常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、Ca MV35S启动子和大豆内源基因Lectin设计引物,同时针对外源基因插入位点的旁临序列设计品系特异性引物。首先进行一次循环数较少(15 cycles),引物浓度较低(0.1μmol/L)的高通量多重PCR,以均匀地扩增各基因模板,同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因。根据熔融曲线分析结果,灵敏度高于普通荧光定量PCR法1个数量级。该方法能够快速、高通量、准确地检测转基因大豆GTS40-3-2中的多种转基因成分,并能对该品系进行分析,重复性好,适合转基因的高通量、定量检测,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2,具有较好的应用价值。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

应用LNA-TaqMan探针实时荧光PCR检测大米制品中转基因成分

大米制品中痕量转基因成分的检测需要特异和超灵敏的检测方法。本研究以行业标准中转基因大米筛查位点CaMV35S启动子、NOS终止子和Cry1A基因为目标,利用在常规TaqMan探针中掺入锁核苷酸提高探针退火温度和杂交特异性等特点,经比较以上位点不同LNA-TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测效果,建立了针对上述筛查位点的基于LNA-TaqMan探针的新型实时荧光PCR检测方法。该方法特异性强,检测灵敏度超高;与普通TaqMan实时荧光PCR方法相比,其反应Ct值可提前1～3 个循环（Cry1A位点除外）,检测低限可达3 pg。该检测方法可以用以检测大米制品中常规实时荧光PCR难以检测到的痕量转基因大米成分。     

转基因棉花MON88913转化体特异性定性、定量PCR检测方法

本文以我国批准商业化的转基因耐草甘膦棉花MON88913为研究对象,建立并验证了其转化体特异性定性、定量PCR检测方法.建立的定性PCR方法的检测极限是20个拷贝棉花单倍体基因组DNA,定量PCR方法的检测和定量极限分别是10和20个拷贝棉花单倍体基因组DNA.同时,我们组织了实验室5位研究人员对建立的定量PCR检测方法进行了协同验证.对5个盲样的定量分析结果显示与真实值的偏差介于1.59% 和10.12%之间,完全满足国际标准25%偏差范围的要求,完全可用于转基因棉花MON88913的实际样品检测.     

应用多重PCR-液相悬浮芯片技术检测转基因水稻品系

开展转基因水稻的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）液相芯片检测方法研究。针对科丰6号（KF6）、科丰8号（KF8）、华恢1号（BT63）、克螟稻（KMD1）、M12、T1C-19、T2A-1、LL62和LL601九种转基因水稻的侧翼序列,设计合成了在生物素标记的多重PCR扩增引物与固定在荧光编码微球上的探针,建立了2 个多重PCR-液相芯片检测体系,可同时检测出这9 种转基因水稻成分。结果表明,9 种转基因水稻的引物和探针都具有较高的特异性,各组引物/探针之间无交叉扩增和非特异杂交,且在多重PCR-液相芯片检测中9 种转基因水稻品系的相对检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。     

Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1

The insect-resistant transgenic rice event TT51-1 (synonym BT63) has been found illicitly planted and distributed for years although it has never been approved for commercial cultivation in any country up to now. The purpose of this study was to establish a detection method that is specific for this transformation event. The event-specific PCR method produces an amplicon of 120 basepairs (bp) based on the revealed 3′ junction sequence with a limit of detection (LOD) and a limit of quantification (LOQ) being approximately 5 and 10 initial template copies, respectively. Two mixed rice samples with known TT51-1 contents were used to verify the developed real-time PCR system, from which the expected results were observed.     

Development and in‐house validation of the event‐specific qualitative and quantitative PCR detection methods for genetically modified cotton MON15985

BACKGROUND: To implement genetically modified organism (GMO) labeling regulations, an event‐specific analysis method based on the junction sequence between exogenous integration and host genomic DNA has become the preferential approach for GMO identification and quantification. RESULTS: In this study, specific primers and TaqMan probes based on the revealed 5′‐end junction sequence of GM cotton MON15985 were designed, and qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) assays were established employing the designed primers and probes. In the qualitative PCR assay, the limit of detection (LOD) was 0.5 g kg^?1 in 100 ng total cotton genomic DNA, corresponding to about 17 copies of haploid cotton genomic DNA, and the LOD and limit of quantification (LOQ) for quantitative PCR assay were 10 and 17 copies of haploid cotton genomic DNA, respectively. Furthermore, the developed quantitative PCR assays were validated in‐house by five different researchers. Also, five practical samples with known GM contents were quantified using the developed PCR assay in in‐house validation, and the bias between the true and quantification values ranged from 2.06% to 12.59%. CONCLUSION: This study shows that the developed qualitative and quantitative PCR methods are applicable for the identification and quantification of GM cotton MON15985 and its derivates. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）和芯片式数字PCR（chip digital PCR,cdPCR）平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。ddPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0copies/μL和8.2copies/μL;cdPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443copies/μL和7.646copies/μL;ddPCR和cdPCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。     

基于单拷贝核基因的数字PCR定量检测肉制品中羊源性成分

GeneBank搜索牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等15种动物的单拷贝核基因组序列信息,应用生物信息学分析筛选15种动物共有的种间保守区域,设计一对可同时扩增15种动物源性DNA的内参基因引物和探针;同时分析筛选绵羊和山羊共有且和其余动物种内特异性区域,设计一对只能扩增羊源性DNA的特异性基因引物和探针。基于微滴数字PCR技术,引入内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立科学准确的肉制品中羊源性成分量化判定方法。结果表明,所建立方法具有良好的特异性和通用性,内参基因和羊种属特异性基因的最低检出限分别为32和26 copies/μL,模拟添加样品的正确度偏差均值为8.66%,符合数字PCR方法制定指南要求不得大于25%,说明量化判定方法结果具有较高的准确性。