宏基因组学技术研究剑南春糟醅细菌多样性特征

利用宏基因组学对剑南春同一窖池不同层糟醅细菌16SrRNA的V4区进行高通量测序,结合数据分析软件对细菌微生物群落进行了多样性分析。按发酵窖池糟醅层从上到下,细菌群落多样性和丰富度逐渐降低。门、科、属水平上各层糟醅优势细菌类别一致,但在丰度上存在差异,其它丰度较低的微生物在不同糟层的分布也各不一样。结果表明同一窖池不同糟层的细菌微生物组成结构存在差异,这些差异是造成各糟层白酒风味不同的重要原因。     

DGGE法初步解析浓香型白酒糟醅微生物群落结构

对沱牌酒厂两个不同窖池的浓香型大曲发酵的黄水浸泡界面糟、中层糟和双轮底糟及蒸馏酒后粮糟样品所提取的总DNA进行细菌V7～V8区、真菌18S rDNA和古菌V3～V4区片段的PCR,后进行DGGE分析,同时对糟醅真菌DGGE图谱中主要优势条带进行克隆测序.结果表明,不同的窖池其糟醅细菌、古菌和真菌群落结构有一定差异,而相同窖池的糟醅细菌、古菌和真菌群落结构具有较大的相似性;浓香型大曲发酵糟醅双轮底糟的微生物种类最为丰富,其次是中层糟.     

浓香型白酒容器及窖池发酵糟醅动态因子变化及白酒品质研究

对浓香型白酒糟醅进行容器和窖池发酵,并对发酵糟醅的常规理化指标、微生物指标、主要香气成分、白酒品质进行对比分析,探讨窖外发酵的可能性。结果表明,容器和窖池发酵糟醅的可培养好氧细菌、酵母和霉菌、温度、水分、酸度、还原糖、淀粉、酒精度、四大酯、三大酸在发酵过程中变化趋势基本相同,均呈先增加后降低的趋势;除己酸乙酯含量差异较大外,其余物质含量差异不大,窖池发酵糟醅己酸乙酯最大值为0.13 g/L,容器发酵糟醅为0.11 g/L。窖池和容器发酵糟醅酒精度在25 d均达峰值,分别为6.7%vol、6.0%vol。窖池发酵二段酒的感官评价优于容器发酵酒,但容器发酵酒的大多数香气成分含量稍高于窖池发酵酒,特别是己酸乙酯含量为窖池发酵酒醅的1.4倍,但二者都能体现浓香型白酒风格。因此,进行窖外容器发酵是可行的。     

控温发酵对浓香型白酒品质变化趋势的研究

利用换热装置控制浓香型白酒窖池的发酵温度,通过对正常发酵与控温发酵窖池糟醅中的水分、酸度、总糖、总酯及香味成分等理化因子进行跟踪监测,探讨发酵温度对窖池糟醅理化因子的影响和对浓香型白酒品质的作用。结果表明,控温措施作用明显,控温条件下进行发酵对突出浓香型白酒的特色具有显著作用。     

黄鹤楼酒生态洞酿细菌群落多样性研究

采用传统微生物分离方法对黄鹤楼酒厂生态洞酿车间空气,窖池上层糟,中层糟,底糟,入窖糟醅,底泥,壁泥,黄水,曲砖等进行菌种的分离、纯化,对细菌的含量进行检测,分析研究黄鹤楼酒厂洞酿车间空气,窖池上层糟,中层糟,底糟,入窖糟醅,底泥,壁泥,黄水,曲砖中的细菌的群落多样性。     

大曲白酒发酵中不同入窖酸度对糟醅微生物群落结构的影响

在白酒的酿造生产过程中,酸度是一项重要的酿造指标。酸胁迫对白酒生产有着重要的影响,主要体现在随着发酵的进行对曲药中的微生物群落结构进行重塑等方面。该研究在实验室构建白酒固态发酵模型,分别设置低、中、高三种酸度条件,探究白酒酿造过程中的酸胁迫对糟醅微生物群落结构的影响。结果表明：在酸度的影响下,产酸细菌和耐酸性强的芽孢杆菌相对丰度增加,耐酸性差的细菌相对丰度降低;真菌门中子囊菌门占绝对优势,窖内溶氧的降低和发酵起始酸度的增加使得真菌属都呈先增后降的趋势。通过分析不同糟醅中各类微生物的数量发现细菌和乳酸菌随酸度的增加而下降;己酸菌在酸度为15 mmol/100 g时数目最多;酵母数量随酸度增加而下降。对糟醅进行理化性质分析,结果显示随着酸度的增加,糟醅中淀粉含量越多;在高酸度下,糟醅中乙醇含量低。该研究分析了酸度对糟醅微生物群落结构的重塑过程,分析了酿造有益菌在不同酸度下的生长情况,能保证有益微生物在良好的条件下生长繁殖,为白酒酿造提供了科学理论指导。     

酱香型白酒窖内发酵过程中糟醅的微生物分析

以郎酒厂第4次酒入窖糟醅正常生产窖池为研究对象，研究发酵过程窖池糟醅中不同空间位置的微生物区系的动态分析。结果表明，酱香型白酒糟醅发酵过程糟醅上、中、下层不同层面的各类微生物区系在数量上存在一定差异，总的分布趋势为上层高于中、下层，兼性厌氧细菌及其芽孢杆菌的数量分布亦是上层略高于中、下层。     

不同处理对浓香型白酒窖外发酵糟醅香气成分和理化的影响研究

该实验对入窖糟醅进行不同处理,在玻璃坛中常温发酵60 d,初步探讨窖泥、黄水中微生物和化学成分对窖外发酵糟醅香气成分和部分理化指标的影响。研究发现,添加窖泥、黄水或窖泥+黄水（灭菌）的发酵糟醅,香味成分种类和含量较入窖糟醅都有增加。与入窖糟醅相比,添加窖泥能促进酯类、酸类、异丁醛、乙缩醛物质的生成;添加黄水能促进酯类、醇类、双乙酰的生成;添加窖泥＋黄水（灭菌）能促进醇类、酸类、糠醛的生成;不同处理对发酵糟醅酸度、还原糖、酒精度含量影响较小,添加黄水的发酵糟醅水分明显高于其他3种糟醅,含量为58.8%,而淀粉明显低于其他3种糟醅,含量为8.95%。     

浓香型白酒窖池糟醅原核微生物区系的分类研究

为了探讨中国传统白酒窖池糟醅中的原核微生物区系的构成及变化,运用PCR扩增技术和16SrDNA序列同源性分析等方法测定糟醅中原核微生物的16SrDNA基因全序列,根据与基因数据库中相似菌群16SrDNA序列的同源性,分析窖池糟醅中原核微生物的生理特性和区系分布。结果发现,发酵60d的浓香型白酒糟醅中,真细菌主要分为6个菌群：低GKmol％革兰氏阳性菌、高G Cmol％革兰氏阳性放线菌群、革兰氏阴性拟杆菌群、革兰氏阴性变形杆菌群、革兰氏阳性纤毛菌群和耵Ⅵ7门,其中β-变形杆菌群约占窖池糟醅中原核微生物的80％;古菌主要为产甲烷古细菌,包括Methanoculleus群和Methanospirillum群。通过不同窖池的比较分析得出,微生物的多样性与窖池微生态密切相关。     

浓香型白酒发酵糟醅的质构特性与发酵参数分析

通过物性测试仪对浓香型白酒窖池发酵糟醅的硬度、粘聚性、内聚性等质构特性进行跟踪测试分析,并对窖期糟醅水分、酸度、淀粉等发酵参数进行了研究。初步探索发酵糟醅的质构特性与理化性质变化之间的关系。     

Spatial Distribution of Bacterial Communities and Related Biochemical Properties in Luzhou‐Flavor Liquor‐Fermented Grains

Grain fermenting with separate layers in a fermentation pit is the typical and experiential brewing technology for Chinese Luzhou‐flavor liquor. However, it is still unclear to what extent the bacterial communities in the different layers of fermented grains (FG) effects the liquor's quality. In this study, the spatial distributions of bacterial communities in Luzhou‐flavor liquor FG (top, middle, and bottom layers) from 2 distinctive factories (Jiannanchun and Fenggu) were investigated using culture‐independent approaches (phospholipid fatty acid [PLFA] and polymerase chain reaction–denaturing gel electrophoresis [DGGE]). The relationship between bacterial community and biochemical properties was also assessed by Canonical correspondence analysis (CCA). No significant variation in moisture was observed in spatial samples, and the highest content of acidity and total ester was detected in the bottom layer (P < 0.05). A high level of ethanol was observed in the top and middle layers of Fenggu and Jiannanchun, respectively. Significant spatial distribution of the total PLFA was only shown in the 50‐y‐old pits (P < 0.05), and Gram negative bacteria was the prominent community. Bacterial 16S rDNA DGGE analysis revealed that the most abundant bacterial community was in the top layers of the FG both from Fenggu and Jiannanchun, with Lactobacillaceae accounting for 30% of the total DGGE bands and Lactobacillus acetotolerans was the dominant species. FG samples from the same pit had a highly similar bacterial community structure according to the hierarchal cluster tree. CCA suggested that the moisture, acidity, ethanol, and reducing sugar were the main factors affecting the distribution of L. acetotolerans. Our results will facilitate the knowledge about the spatial distribution of bacterial communities and the relationship with their living environment.     

酱香型白酒第四轮次堆积发酵醅堆腰线微生物菌群多样性解析

采用纯培养和Illumina MiSeq高通量测序技术对第四轮次堆积发酵正常和腰线酒醅中的微生物菌群多样性进行解析。通过纯培养计数发现,酒醅腰线处乳酸菌、细菌以及酵母和霉菌的数量均显著高于正常酒醅（P<0.05）。经α多样性分析发现,正常和腰线部位酒醅细菌及真菌菌群的丰度和多样性差异均不显著（P>0.05）。经β多样性分析发现,两处酒醅中细菌类群差异不显著（P>0.05）,而真菌类群差异显著（P<0.05）。经Wilcoxon test检验发现,酒醅腰线处芽孢杆菌（Bacillus）和丝衣霉属（Byssochlamys）的相对含量显著偏高（P<0.05）,而毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）、有孢圆酵母属（Torulaspora）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）显著偏低（P<0.05）。相关性分析发现,腰线部位酒醅微生物菌群间相较于正常部位存在更加密切的联系。由此可见,腰线与正常部位酒醅的微生物类群差异主要体现在真菌类群上。     

高通量测序在酱香白酒微生态多样性研究中的应用

通过提取酱香型白酒生产发酵过程3轮次、7轮次酒醅微生物基因组DNA,采用高通量测序技术对酒醅中的微生态多样性进行测序分析。结果表明,酱香型白酒发酵过程3轮次酒醅（L3）中乳杆菌属（Lactobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）是原核微生物中绝对优势菌,而7轮次酒醅（L7）中盐单胞菌属（Halomonas）是原核微生物中最优势菌属;同时在L3样品中嗜热真菌属（Thermomyces）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）是发酵过程真核微生物中的绝对优势菌,而在L7样品中隐球菌属（Cryptococcus）则是真核微生物中的最优势菌属。对比两轮次酒醅中微生物分析结果,二者的微生态多样性存在较大的差异。分析认为可能正是因为两轮次酒醅中微生物在发酵过程中处于动态变化的差异性,导致两个轮次生产出的酒在产量和质量风味上自然存在较大的差异。     

浓香型酒醅微生物群落与理化指标的相关性分析

本试验研究了浓香型酒醅一个发酵周期中主要的微生物群落变化规律和酒醅理化指标(淀粉、还原糖、乙醇、总酸和温度)变化规律,再分析这两者之间的相关性。结果表明:在发酵过程中,温度和还原糖呈先上升后下降最后保持平稳,乙醇和总酸呈先上升后保持平稳,淀粉含量一直下降;细菌多样性指数都在2.12~2.80之间,真菌多样性指数都在1.68~2.61之间;酒醅细菌群落的多样性与淀粉的相关系数为0.717(P0.01),与还原糖的相关系数为0.744(P0.01),与总酸的相关系数为-0.704(P0.01),与乙醇的相关系数为-0.838(P0.01),与发酵温度的相关系数为0.622(P0.05);浓香型酒醅真菌群落的多样性与淀粉的相关系数为0.561(P0.05),与其它理化指标的相关性均不显著;选择细菌5号和6号条带进行割胶测序,得到该条带的菌属为芽孢杆菌属(Bacillus subtilis sp)和假单胞杆菌属(Pseudomonas sp)。     

“FD工艺”对酱香型白酒堆积过程的影响

为探究酱香型白酒酿造堆积过程中酒醅堆各位点发酵状态及细菌群落结构的变化规律,将“FD工艺”应用于酱香型白酒第二轮次酒生产堆积发酵过程,对堆积过程中的酒醅理化因子和细菌群落变化进行探索和研究。结果表明:相较于传统酒醅堆积发酵而言,“FD工艺”处理后的酒醅酸度能够有效降低,酸度下降了1.72 mmol/10 g,同时能有效控制酒醅中水分含量,使水分含量保持在±0.8%;“FD工艺”能有效促进淀粉转化（增加转化了0.76%）,同时酒醅中还原糖含量也增加（增长了0.46%）;酒醅细菌群落Shannon指数、Sobs指数和Ace指数显著（P<0.05）增加;“FD工艺”处理后的酒醅微生物属分类水平的丰富度和多样性明显增加,有利于好氧菌属如芽孢杆菌属Bacillus、高温放线菌属Thermoactinomyces等微生物生长。综上,“FD工艺”能改善堆积发酵过程中酒醅发酵不均的情况,酒醅细菌群落丰富度和多样性均明显增加,有利于优势好氧及耐高温细菌群落的生长。     

特香型白酒酿造过程中真核微生物菌群演替

采用高通量测序技术对特香型白酒酿造过程中的真核微生物菌群演替动态变化进行分析。方法:分别于发酵窖池内采集底糟样品(0、30 d)和表层与下层酒醅样品(0、3、6、10、15、20、25、30 d),洗脱表面微生物,提取基因组DNA,进行聚合酶链式反应扩增和高通量测序分析。结果表明:在整个发酵周期内,酒醅中的真核微生物菌群多样性与丰度呈现明显下降趋势,优势菌目为Saccharomycetales(酵母目),优势菌属依次为Saccharomyces(酵母属)、Pichia(毕赤酵母)、Galactomyces(耐碱酵母属);相比酒醅而言,底糟真核微生物菌群构成更为复杂,主要优势菌群包括Saccharomycetales(酵母目)、Eurotiales(散囊菌目)、Capnodiales(煤炱目)和Tremellales(银耳目)等;对整个发酵过程中的菌群结构进行主坐标分析,结果显示表层酒醅与下层酒醅在真核微生物菌群结构上没有明显的差异。     

宜宾产区浓香型白酒窖房空气、窖泥和糟醅可培养细菌的相关性

采用经典微生物学方法及16S rRNA序列分析,对宜宾多粮浓香型白酒酿造车间空气、窖泥及发酵糟醅中细菌群落及部分酿造性能进行比较分析。结果表明：Bacillus cereus、B. methylotrophicus及B. tequilensis细菌在酿造车间内分布最广;3个取样点中,糟醅和窖泥中细菌群落的相似性指数最高,达85%;耐乙醇或分解淀粉的细菌主要分布于糟醅;耐乙酸细菌主要分布于窖泥;空气中分离到的细菌既不耐乙醇,也不耐乙酸。表明长期开展多粮浓香型白酒生产的酿造车间内已形成具备一定多样性、与酿造环境相适应、相对稳定的细菌群落;窖房空气、糟醅、窖泥中细菌群落相互间均存在相关性,且糟醅与窖泥细菌群落密切相关。     

酱香型白酒第二轮次酒发酵过程微生物多样性研究

为探究酱香型白酒二轮次发酵过程中微生物群落结构的变化、微生物多样性以及物种与样品之间的关系,应用高通量测序技术对酱香型白酒第二轮次酒生产堆积及窖池发酵过程酒醅中微生物的多样性及其主要功能菌群进行研究。结果表明,在堆积过程中共检测到细菌138个属,真菌54个属;窖池发酵过程中共检测到细菌262个属,真菌267个属。酒醅中主要细菌类群为Firmicutes和Proteobacteria,主要真菌类群为Ascomycota和Basidiomycota。堆积过程中绝对优势细菌属有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus;绝对优势真菌属有Thermoascus、Thermomyces、Candida、Aspergillus。在窖池发酵酒醅中其绝对优势细菌属为Lactobacillus;绝对优势真菌属为Saccharomyces、Candida、Penicillium、Fusarium。由于堆积、窖池发酵酒醅所处发酵环境、发酵物料物态及其工艺参数差异较大原因,使得两者之间生物物种存在较大差异。     

君丰大曲酱香白酒出池酒醅特性与各轮次基酒风味相关性分析

对君丰大曲酱香白酒酿造过程出池酒醅的理化指标进行分析,采用高通量测序技术解析酒醅中微生物菌群变化规律,利用气质联用（GC-MS）分析轮次酒的风味物质构成,并阐释酒醅特性与风味物质的相关性。结果表明,在白酒酿造过程中,出池酒醅水分含量、酸度、还原糖含量均呈现先增加后降低,至5～6轮次略有回升的趋势,淀粉含量呈现不断降低的趋势。酒醅中共检测出71种细菌属和43种真菌属,优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、unidentified Mitochondria等,优势真菌属为伊萨酵母属（Issatchenkia）、毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）等。相关性分析结果表明,毕赤酵母属（Pichia）、醋酸杆菌属（Acetobacter）等受淀粉和还原糖影响比较大,接合酵母属（Zygosaccharomyces）、明梭孢属（Monographella）和海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）等受水分和酸度影响比较大,与风味物质相关性较强的微生物有假单胞菌属（Psedomonas）、片球菌属（Pediococcuspichia）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）和假丝酵母属（Candida）等。     

不同形态外源硒元素对白酒酒醅菌群的影响

探究不同形态硒元素的添加对白酒酒醅微生物菌群的影响。在白酒酿造酒醅中添加外源硒进行发酵,采用高通量测序对发酵完成的酒醅样品解析其真菌和细菌微生物群落特征。结果表明,未添加外源硒、添加有机硒和添加无机硒的三组白酒酒醅样品之间的细菌菌群的α-多样性指数存在显著性差异（P＜0.05）,添加外源硒样品的操作分类单元（OTUs）数目和Shannon指数数值较高,Chao1指数较低,在细菌的β-多样性中,硒的添加增加了变形菌门（Proteobacteria）在群落中的占比,添加无机硒后放线菌门（Actinobacteria）成为酒醅中优势菌门,外源硒的添加提高了白酒酒醅细菌菌群的多样性;真菌菌群的α、β多样性不具有显著性差异（P＞0.05）。研究结果表明,外源硒的添加（5 mg/kg）对白酒酒醅细菌菌群的群落结构有一定影响。