北京地区牛、羊肉片中鸭、鸡、猪源性成分调查

建立生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的荧光PCR检测方法,对北京地区出售的牛、羊肉片进行成分调查。方法 合成检测鸭、鸡、猪源性成分的特异性引物和探针,建立实时荧光PCR检测方法,测定方法的特异性、灵敏度,在北京部分超市、农贸市场、餐馆采集牛、羊肉片进行成分调查。结果 所建立的实时荧光PCR方法对鸭、鸡、猪源性成分具有较好特异性,与常见食用肉类DNA在Ct 30以内无交叉反应;对混合肉中鸭、鸡、猪成分DNA的检出限是0.1%。北京市场上采集的86份牛、羊肉片中,30份检出上述成分,占34.9%;羊肉片的掺假率高于牛肉片;农贸市场采集样品掺假率明显高于超市和餐馆。结论 所建生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的检测方法简单、特异,对样品的检测结果显示,北京市售牛、羊肉中存在掺入鸭、鸡、猪肉的现象。     

肉制品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法 以鸭生长激素(growth hormone, GH)基因为靶基因, 基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针, 优化反应体系和反应条件, 建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。结果 所建立的real-time PCR方法特异性强, 仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线, 对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线; 灵敏性高, 以鸭基因组DNA为模板, 检出限为1.0 pg; 重复性好, 不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测, 在11份肉制品中检出鸭源性成分, 同现行行业标准SN/T 3731.5—2013检测结果一致。结论 本研究所建立的real-time PCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点, 适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。     

实时荧光PCR技术快速检测食品中的牛源成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的食品中牛源性成分快速检测方法.方法:以牛线粒体细胞色素b为目的基因,设计特异性引物和探针,通过特异性、灵敏性实验,及模拟混合肉样和市售肉制品检测,对该体系进行验证.结果:该牛源荧光PCR检测体系具有很好的特异性及灵敏性,可检测1pg牛源DNA的存在,对于各模拟肉类样品中掺杂的牛源性成分,其检测限低至0.5％,且经市售加工食品验证具有较好的应用能力.结论:所建立的牛引物探针体系具有特异性好、灵敏度高,快速高效等优点,可用于对食品中牛源性成分的掺假鉴别检测.     

普通聚合酶链式反应鉴定牛肉及其制品中的牛源性成分

依据牛种属的线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因上的保守序列设计牛源特异性引物对,建立一种特异性强、灵敏性高、耗时短的鉴定食品中牛源性成分的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。选取牦牛、水牛、黄牛品种及羊、猪、鸡、鸭、鹅、兔、马、驴、鱼、大豆、玉米等动植物源成分进行特异性试验。结果显示:所建立的方法高度特异于牛源性检测,其他非牛动植物源成分均无扩增条带。采用常见的牛品种进行灵敏性试验,结果显示所建立的方法可检测到的最低牛DNA量为0. 2 pg;将牛肉分别与猪肉、驴肉、羊肉、大豆组织混合进行PCR测定,结果表明最低检测限为鲜样品含0. 01%质量分数的牛源成分,高压121℃、0. 1MPa,20 min处理样品含0. 01%质量分数的牛源成分。对市售食品中牛源性成分检测结果与现行PCR牛源性成分检测标准方法的检测结果 100%一致。     

Taqman探针荧光聚合酶链式反应实时同步鉴定动物源性食品中猪肉、鸡肉源性成分

目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)序列设计、合成特异性引物及不同荧光标记(FAM、HEX)的Taqman探针,建立可同步检测动物源性食品中的猪源性和鸡源性成分的Taqman探针双重荧光PCR方法。结果:所建立的Taqman探针双重荧光PCR检测方法特异性强,仅对猪、鸡成分有扩增;灵敏度高,最低检测到猪源、鸡源DNA的含量分别为0.02、0.10 ng;抗干扰性强,当DNA混样中猪源、鸡源性成分含量在2%以上水平时,所建立的混合检测体系均能对DNA混样给出正确判断。结论:所建立的混合检测体系具有高特异性、高灵敏度,能够适用于动物源性食品中猪肉、鸡肉成分的同时快速检测。     

肉类掺假的分子生物学检测

针对Gene Bank中公布的牛羊猪鸡鸭线粒体细胞色素氧化酶亚基基因的特异性序列设计引物,建立了肉样的5种常见牛羊猪鸡鸭动物源性成分检测的PCR电泳法体系。采用大连宝生物的猪源牛源羊源鸡源性成分检测试剂盒和广州迪奥生物的鸭源性成分检测试剂盒,利用实时荧光PCR检测体系对河南省范围内几个大型超市的118批次牛肉样品的5种即猪牛羊鸡鸭动物源性成分进行了检测。结果显示:牛源性成分检出117批次检出率99.15%,猪源性成分检出10批次检出率8.47%,鸡源性成分检出7批次检出率5.93%,鸭源性成分检出1批次检出率0.85%,没有检出羊源性成分,其中熟肉制品掺杂其他源性成分的比例较高。与配料表对比掺假使假样品共9批次,总掺假率为7.63%。     

实时荧光PCR检测饲料中鸭源性成分

根据GenBank中的鸭线粒体DNA基因片段序列,用Primer6.0软件设计针对鸭的特异性扩增引物及探针,建立一种检测鸭源性成分的实时荧光PCR方法.以鸭、鸡、鹅、牛、羊、猪、马、鸽、水貂、鱼、猫肌肉组织DNA进行实时荧光PCR反应,只有鸭具扩增曲线,其余样品和空白对照则无扩增曲线,说明该引物及探针只对鸭有特异性.对不同含量的鸭肉粉进行实时荧光PCR反应,结果表明灵敏度约为0.01％(质量分数).     

食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法的建立

目的：建立基于实时荧光聚合酶链式反应技术的食品中鸡源性成分快速检测方法。方法：以鸡线粒体细胞 色素b为目的基因,设计特异性引物和探针,通过特异性、灵敏性实验及模拟混合肉样和市售肉制品检测,对该体 系进行验证。结果：该鸡源荧光聚合酶链式反应检测体系具有很好的特异性及灵敏性,可检测3.5 pg/μL鸡源DNA 的存在;经含鸡源成分的模拟混合肉样检测,证实体系抗干扰能力强;并且通过市售食品检测表明体系可用于定性 加工食品中的鸡源成分。结论：所建立的鸡源引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速高效等优点,可用于对 食品中鸡源性成分的掺假鉴别。     

应用通用引物量化检测鲜肉及其制品中羊源性成分

分别以牛、羊、猪、鸡、鸭、马线粒体细胞色素b基因为研究对象,设计羊源性成分特异性引物和探针,同时结合实时荧光定量PCR技术,引入16SrDNA内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立快速、高通量的鲜肉及鲜肉制品中羊源性成分确证方法,实现科学准确的食品掺假量化判定技术体系。通过特异性、通用性及模拟混合样品的检测,对所建立方法进行验证。结果表明:建立的羊源性成分含量测定方法具有良好的特异性和通用性,且通过标准曲线的构建,呈现良好的线性关系均达0.996以上;通过羊种属特异性基因与16SrDNA内参基因Quantity值及校正系数,可以计算出样品中所含羊源性成份的质量百分比含量,经模拟混合样品的检测,回收率平均值到达96.25%,说明量化研究结果具有较高的准确性。     

种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分

建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分种属特异性PCR鉴别方法。通过使用猪、牛、羊、鸡、鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA模板进行PCR扩增,得到分别为212、147、202、131、201 bp的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)进行BLAST比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测。该方法5种动物引物种属特异性良好,对猪、牛、羊、鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%。在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符。该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值。     

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）,以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量（x1）与基因拷贝数浓度（ y 2） 之间的关系式为： 鸡：x1=（n*y2）/273.946 - n/886.557 + 0.216; 猪：x1=（n*y2）/64.950 + n/60.644 + 0.215; 牛：x1=（n*y2）/62.839 + n/12.646 + 1.218（n为稀释倍数）;基于建立的ddPCR方法对64 份市售不同种类香肠样品进行检测,在1 份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。     

实时荧光PCR检测鸭血中的动物源性成分

目的建立实时荧光PCR检测鸭血中鸭、猪、牛等动物源性成分的方法。方法对重庆市火锅店销售的鸭血进行采样检测。提取鸭血样品DNA,进行实时荧光PCR检测,确定循环阈值,分析样品中鸭、猪、牛源性成分。结果 DNA提取液OD_(260 nm)/OD_(280 nm)值为1.8～2.0,纯度较高; 8个市售鸭血样品中2个样品只检出猪源性成分, 1个样品同时检出鸭源性成分和猪源性成分,研究发现所采集的鸭血存在猪血掺假的可能。结论该方法快捷、可操作性强,适用于鸭血中动物源性成分的测定。     

GNM C7-8实时荧光PCR同时快速检测8种动物源性成分

目的基于八模块设计的GNMC7-8实时荧光PCR系统实现对8种动物源性成分同时快速检测。方法基于猪朊蛋白基因、牛生长激素基因、羊生长激素基因、驴线粒体ATPase 6基因、马线粒体ATPase 6基因、鸭生长激素基因、水貂线粒体细胞色素b基因、狐狸线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因引物设计了8种动物源性成分实时荧光PCR检测方法。应用GNMC7-8实时荧光PCR系统,对8种动物源性成分启动同时检测和每隔5min顺序启动不同时检测,并将检测结果和ABI7500荧光PCR分别检测结果进行比较。结果 GNM C7-8实时荧光PCR系统同时检测猪、牛、羊、驴、马、鸭、水貂、狐狸8种动物源性成分,起峰周期数分别为30、27、21、21、24、17、15、17,与其不同时检测结果一样,与ABI7500荧光PCR系统检测结果相比,猪、羊、马、鸭、水貂5种成分的起峰快1～2个周期数,其余3种成分检测结果一致,检测完成时间少16～20 min。结论 GNM C7-8实时荧光PCR系统8个模块独立运行,互不干扰,无交叉污染,能够同时快速检测8种动物源性成分,为快速筛查动物源性成分提供强有力的设备技术支持。     

Application of quantitative real-time PCR in the detection of prion-protein gene species-specific DNA sequences in animal meals and feedstuffs

This study describes a method for quantitative and species-specific detection of animal DNA from different species (cattle, sheep, goat, swine, and chicken) in animal feed and feed ingredients, including fish meals. A quantitative real-time PCR approach was carried out to characterize species-specific sequences based on the amplification of prion-protein sequence. Prion-protein species-specific primers and TaqMan probes were designed, and amplification protocols were optimized in order to discriminate the different species with short PCR amplicons. The real-time quantitative PCR approach was also compared to conventional species-specific PCR assays. The real-time quantitative assay allowed the detection of 10 pg of ruminant, swine, and poultry DNA extracted from meat samples processed at 130 degrees C for 40 min, 200 kPa. The origin of analyzed animal meals was characterized by the quantitative estimation of ruminant, swine, and poultry DNA. The TaqMan assay was used to quantify ruminant DNA in feedstuffs with 0.1% of meat and bone meal. In conclusion, the proposed molecular approach allowed the detection of species-specific DNA in animal meals and feedstuffs.     

实时荧光聚合酶链式反应检测肉制品中的鸭源性成分

通过鸭的肌动蛋白β-actin保守基因设计可特异检测鸭肉成分的引物和探针,建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测鸭肉的方法,并通过模拟肉样和市售样品检测方法的准确性和适用性。结果表明：该方法可以特异性检测出麻鸭和草鸭成分,而对猪、牛、羊、鸡等DNA均没有扩增,检测灵敏度可达到1 pg DNA;通过模拟肉样检测确定最低质量分数检测限为0.01%;市售样品的检测结果表明,该方法能很好地应用于市场,满足市场检测需求。     

素食中动物源性成分的PCR检测方法的研究

建立了素食产品中动物源性成分的实时荧光PCR检测方法,该方法特异、灵敏,仅通过检测一个基因位点即可判断素食产品中是否含有动物源性成分,对来源于畜类、禽类及鱼类动物源性成分的检出限分别为0.01%,0.05%,0.1%。运用该方法对市场上22份不同类型的素食产品进行了检测,检出2份产品中含有动物源性成分。该方法操作方便快捷,适用于素食中动物源性成分的定性检测。     

Real-time PCR for quantitative detection of bovine tissues in food and feed

A real-time PCR approach with the SYBR Green detection system has been developed for the quantitative detection of bovine tissues in food and feedstuffs. The method combines the use of bovine-specific primers, which amplify an 84-bp fragment of the mitochondrial 12S rRNA gene, and universal primers, which amplify a 140-bp fragment of the nuclear 18S rRNA gene from eukaryotic DNA. The 18S rRNA primers are used as endogenous controls for the total content of PCR-amplifiable DNA in the sample. The specificity of the primers was tested against 18 animal species, including mammals, birds, and fish, as well as 6 plant species. Analysis of experimental bovine tissues-oats mixtures demonstrated the suitability of the assay for the detection of bovine DNA in mixtures containing as low as 0.1% of bovine tissues. The performance of the method is not affected by severe heat treatment (up to 133 degrees C for 20 min at 300 kPa). The reported PCR assay could be very useful for detecting bovine-derived ingredients in raw and heat-treated food and feedstuffs.     

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴 成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异 性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。 结果表明：本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑 12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%; 方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。     

食用植物油中动物源性成分PCR检测方法的建立

本文建立了应用PCR技术快速鉴别食用植物油中动物源性成分的方法。以食用植物油中掺入的动物源性基因为靶标,自行设计16S rRNA基因通用引物,同时选用动物物种特异性引物进行PCR扩增,分别得到相应的目的片段。通过三对16S rRNA基因通用引物,建立了从食用植物油中快速检测是否含有动物源性成分的方法;利用所选的动物物种特异性引物,进一步建立了从食用植物油中鉴定猪、牛、羊、鸡、鱼5种动物源性成分的方法,此方法能检测出含有0.1%(m/m)动物源性成分的植物油。     

鸭肉冒充牛羊肉的分子生物学检测

针对送检牛肉和羊肉样品,设计合成检测动物源性成分的通用引物,并对PCR产物测序后在NCBI数据库中进行比对;根据牛、羊、鸭源性成分检测的相关标准,合成引物和探针,进行送检样品中牛、羊和鸭源性成分的实时荧光PCR检测.结果表明:在7份送检样品中4份检测到鸭源性成分,2份检测到牛源性成分,1份检测到羊源性成分.实时荧光PCR方法灵敏性更高、特异性更强、结果判定更为迅速.