肉制品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法 以鸭生长激素(growth hormone, GH)基因为靶基因, 基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针, 优化反应体系和反应条件, 建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。结果 所建立的real-time PCR方法特异性强, 仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线, 对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线; 灵敏性高, 以鸭基因组DNA为模板, 检出限为1.0 pg; 重复性好, 不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测, 在11份肉制品中检出鸭源性成分, 同现行行业标准SN/T 3731.5—2013检测结果一致。结论 本研究所建立的real-time PCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点, 适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。     

肉制品中表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据表皮葡萄球菌16S基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的表皮葡萄球菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有表皮葡萄球菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/mL。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

食品中铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测的研究

根据铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个Taq Man探针,建立铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的铜绿假单胞菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,只有铜绿假单胞菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及Taq Man探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3 CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

常见肉类中鸭源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的通过筛选引物、探针体系,优化PCR反应条件,建立常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法。方法针对线粒体基因设计50对引物探针,以鸭DNA为模板,利用PCR和荧光PCR方法筛选引物探针并确定反应条件,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,最终确定荧光定量PCR方法的引物、探针及反应条件。结果当样本含量为0.1%时,本方法仍可特异、灵敏地检出鸭肉成分,检测Ct值可稳定在20以下。结论建立了常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法,可用于肉类制品中鸭源性成分的鉴定。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立

建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。方法 根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异。结果 采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r²=0.999,扩增效率为99.972%,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P﹤0.01;△Rn:t=14.230,P﹤0.01)。结论 本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值。     

驼乳中布鲁氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立驼乳中布鲁氏菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法 根据布鲁氏菌外膜蛋白omp10基因的碱基序列,设计引物其探针,从模拟布鲁氏菌污染的驼乳中提取布鲁氏菌DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果 该方法从布鲁氏菌M5株中扩增出了特异性目的片段omp10,而对大肠埃希式杆菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过10倍倍比稀释的模板进行检测,该方法的灵敏度为最低可检出2.31×10-4 ng/μL的DNA。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9928,扩增效率E=0.97。结论 建立的实时荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点,为驼乳中布鲁氏菌病的早期预防及流行病学监测提供了有效的技术手段。     

北京地区牛、羊肉片中鸭、鸡、猪源性成分调查

建立生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的荧光PCR检测方法,对北京地区出售的牛、羊肉片进行成分调查。方法 合成检测鸭、鸡、猪源性成分的特异性引物和探针,建立实时荧光PCR检测方法,测定方法的特异性、灵敏度,在北京部分超市、农贸市场、餐馆采集牛、羊肉片进行成分调查。结果 所建立的实时荧光PCR方法对鸭、鸡、猪源性成分具有较好特异性,与常见食用肉类DNA在Ct 30以内无交叉反应;对混合肉中鸭、鸡、猪成分DNA的检出限是0.1%。北京市场上采集的86份牛、羊肉片中,30份检出上述成分,占34.9%;羊肉片的掺假率高于牛肉片;农贸市场采集样品掺假率明显高于超市和餐馆。结论 所建生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的检测方法简单、特异,对样品的检测结果显示,北京市售牛、羊肉中存在掺入鸭、鸡、猪肉的现象。     

实时荧光PCR技术快速检测莲蓉制品中芸豆成分

目的:建立基于实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测莲蓉制品中芸豆成分的方法。方法:以芸豆pvsbe2基因高度保守区域设计特异性引物和探针,通过对莲子及其他富含淀粉类植物DNA进行扩增,以验证方法的特异性;以1 ng/μL的芸豆DNA进行系列稀释,确定此法检测灵敏度;对含有1%芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍梯度稀释,确定重量检测灵敏度;并应用此方法和PCR方法对市场样品进行了检测,对建立的荧光PCR方法进行验证。结果:该检测方法具有高度特异性,与莲子及其他高淀粉植物无交叉反应;DNA质量浓度的检测灵敏度达到1 pg/μL,重量检测灵敏度可达0.01%。含芸豆成分的莲蓉月饼扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:本研究建立的实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便的特点,更适合莲蓉制品中芸豆成分的快速检测。     

肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR检测

通过实时荧光PCR技术检测肉制品中鸵鸟源性成分。根据鸵鸟线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COX1)序列,用Primer Express和DNAMAN软件设计特异性的引物和Taq Man探针,并用阳性样本进行验证。结果表明,引物和探针对鸵鸟源性成分的特异性良好,与常见物种DNA无非目标扩增,该方法的检测灵敏度达0.27 pg/反应,适用于鸵鸟源性成分的鉴定,从而建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法 。     

TaqMan实时荧光PCR检测菰米成分的方法建立

本研究建立了一种能够快速检测食品中菰米成分的TaqMan实时荧光PCR方法。以菰米核糖体内转录间隔区（internal transcribed space, ITS）基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,建立菰米成分的实时荧光PCR检测方法,并进行物种特异性分析、灵敏度分析以及实际应用检测。结果显示:本研究所建立的实时荧光PCR检测方法特异性强,仅对菰米品种中国菰（Z. latifolia）、水生菰（Z. aquatica）、沼生菰（Z. palustris）和德克萨斯菰（Z. texana）基因组DNA出现特异性扩增曲线,供试的其他30种谷物以及异源性动植物基因组DNA均无扩增曲线;该方法对菰米成分检测的灵敏度为0.001 ng/μL菰米基因组DNA或0.01%（W/W）菰米粉。应用该方法对100份市售的进口菰米、菰米碎米、杂粮米及混合米粉等样品进行检测,在80份进口菰米和5份菰米碎米中检测出菰米成分,其他样品中未检出菰米成分,与商品标识一致。该方法灵敏度高,特异性强,可快速高效地进行菰米成分的真实性甄别。     

牛奶β-乳球蛋白质实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种快速、特异、灵敏的Taqman实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,用于牛奶主要过敏原β-乳球蛋白质的检测。根据Gen Bank登录的牛β-乳球蛋白质的DNA序列设计,合成一对特异性引物和探针。将扩增产物连接到p MD19-T载体上,制备质粒标准品并测序鉴定,10倍梯度稀释含有β-乳球蛋白质基因的重组质粒,进行实时荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,检测该方法的特异性、稳定性、灵敏性,同时将建立的方法用于10种市售食品的检测。成功建立了β-乳球蛋白质的实时荧光定量PCR检测方法,标准曲线的Ct值与模板浓度在3.18×103~3.18×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.997 8;检测灵敏度高(318 copies/μL);特异性强,对羊奶、豆浆DNA均无扩增反应;稳定性好,组内、组间的变异系数均在5%以内。对10种食品牛奶过敏原的检测结果与标签相符。表明所建立的实时荧光定量PCR方法可应用于食品中牛奶过敏原β-乳球蛋白质的检测并可推广到其它过敏原的检测。     

实时荧光PCR法快速检测肉类中貉源性成分

目的建立貉源性成分的实时荧光PCR快速检测手段。方法根据貉的线粒体Cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行实时荧光PCR(RT-PCR)扩增,产物进行快速检测。结果此方法特异性良好,灵敏度可达到10~(-4)ng貉源性DNA的量。在混合或纯肉样品以及常见的肉制品中均可检测。结论本方法可以满足实际工作中肉类掺假检测的要求。     

荧光PCR法检测畜禽肉中的鸡源性成分

为了建立畜禽肉中鸡源性成分荧光定量PCR检测方法,以鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、兔、鸽和鹌鹑等9种动物线粒体DNA 16S rRNA基因序列为靶位点,通过比对分析设计筛选出鸡特异性引物,以9种动物肌肉DNA为模板进行特异性扩增,确立荧光定量PCR扩增条件;同时将鸡DNA模板浓度进行10倍梯度稀释,一直稀释至108倍,检测所建立的荧光PCR方法的灵敏度;并用此方法对市场上样品进行随机抽检。结果显示:所设计的鸡引物仅对鸡肉DNA模板有典型扩增曲线,Ct值为22.11,对其它动物DNA模板无扩增,特异性较强;当鸡DNA模板稀释倍数达到104倍,即DNA浓度为17.5 pg/μL时,仍有典型扩增曲线,Ct值为30.37,方法灵敏度较高;市场流通环节样品抽检结果显示所抽测样品均合格。可见,建立的基于荧光定量PCR和线粒体DNA 16S rRNA基因的畜禽肉中鸡源性成分检测方法,快速而准确,实用性强。     

肉制品中鸭源性成分的实时荧光PCR检测

目的：建立基于实时荧光PCR技术的鸭源性成分的快速检测方法。方法：以鸭线粒体DNA序列为目的基因,设计并筛选了鸭源性特异性引物及探针,进行荧光定量PCR扩增,建立鸭源性成分检测方法。通过特异性、灵敏性、及盲样检测试验,对该体系进行验证。结果：该方法能够快速有效的检测鸭源性成分,具有较强的特异性及灵敏性,灵敏度约为0．01％（质量分数）;通过市售盲样肉制品的检测,表明该体系可用于定性检测加工肉制品中的鸭源性成分。结论：该方法特异性强,灵敏度高,可用于对肉制品中鸭源性成分的掺假鉴别。     

基于实时荧光PCR的鹅鸭混合绒定量检测

传统的羽绒品种定量检测方法为显微镜检测法,费时长且依赖检测人员的经验。本研究建立了基于实时荧光PCR技术的鹅鸭混合绒定量检测方法。通过设计针对鹅、鸭线粒体DNA序列的特异性引物和Taq Man探针,且两组引物探针具有几近相同的扩增效率,建立羽绒品种检测的定量标准曲线(R20.99)。以不同产地的鹅鸭混合绒验证该方法,均得到较好结果,证明线粒体拷贝数对定量结果基本没有影响。该方法有望用于羽绒品种的大批量快速定量检测。     

同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光聚合酶链式反应方法的建立及应用

以鸡转化生长因子β-3(transforming growth factor beta-3,TGFB3)基因、猪朊蛋白(prion protein,PRNP)基因和鸭、牛生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,设计合成特异性引物和TaqMan探针,通过对实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系和反应条件的优化,建立同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:本研究所建立的方法只在鸡、鸭、猪或牛源性成分存在时才产生特异性扩增曲线,表明该方法具有良好的特异性;且对鸡、鸭、猪和牛源性成分的最低检测质量浓度分别可达到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL,具有良好的灵敏性;应用建立的检测方法对市售34份速冻食品鸡、鸭、猪和牛源性成分进行同时检测,能够实现对速冻食品中4种动物源性成分的有效检测,进一步分析发现,15份速冻食品源性成分测定结果与外包装标注成分不一致。本研究所建立的同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性,且操作简单、适用范围广,能够满足日常检测需求。     

实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

实时荧光PCR技术快速检测奶制品中掺入的大米源性成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的奶制品中掺入大米源性成分的快速检测方法。方法:以水稻的根部表达基因(gos9)为靶基因设计特异性引物和探针,经特异性实验和灵敏度实验验证引物探针可行性,并经模拟含大米奶粉及市售奶类制品检测验证其实际检测能力。结果:该引物探针体系只针对大米DNA进行扩增,与奶类主成分牛、羊及其它谷类和植物性食物DNA均无交叉扩增;最低能检测到0.1ng的大米DNA,对含大米粉的模拟混合奶粉样品,检出限可达0.1%(W/W)。将其应用于21份市售奶制品样品检测,对含大米源性成分的奶制品扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:该实时荧光PCR检测体系具有快速、特异、灵敏的优点,可以准确鉴定出奶制品中大米成分,适用于奶类中掺加大米源性成分的检测。     

基于TaqMan探针荧光定量PCR技术快速检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因序列分析、对比,设计特异性引物和Taq Man探针,建立对金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测方法,并验证该方法的特异性、稳定性和灵敏性。结果:Taq Man探针荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A具有极强特异性,标准曲线相关系数为0.998,最低可检测出71个拷贝数的细菌DNA,检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A菌灵敏度为1.3×102CFU/m L,不同浓度质粒重复性扩增试验Ct值的变异系数均3%,显示了良好重复性。结论:Taq Man探针荧光定量PCR方法可以在6h内快速、准确地检出金黄色葡萄球菌肠毒素A,为金黄色葡萄球菌快速检测和食物中毒快速诊断提供技术支撑,推动了荧光PCR技术在食品安全检测方面的实践应用。