重组人骨形成蛋白-2的质量控制

目的建立重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)质控方法和质量标准。方法以小鼠体内异位成骨试验测定rhBMP-2的生物学活性,HPLC-SEC法测定纯度,蛋白N-末端测序仪测定N-末端15个氨基酸残基序列,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果1批rhBMP-2原液鉴定结果显示,样品比活性为5.9×104BU/mg,纯度为97.6%,N-末端序列为(MKR)LKSSCKRHPLYV,其余项目检测结果均符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论该质控标准可用于rhBMP-2产品的常规检定。     

重组人尿激酶原质控方法和质量标准的研究

目的建立重组人尿激酶原的质控方法和质量标准。方法以纤维蛋白平板法测定重组人尿激酶原的生物学活性,S-2444发色底物法测定单双链比例,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和分子筛色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于重组人尿激酶原产品的常规检定。     

胰高血糖素样肽-1融合蛋白生物学活性检测方法的建立及验证

目的建立胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白(GLP1-Fc)生物学活性荧光素酶报告基因测定方法,并进行验证。方法采用电穿孔法将GLP-1受体(GLP-1R)表达载体和cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)报告基因共转染入HEK-293细胞中,通过加入潮霉素B筛选和单克隆培养,获得稳定转染的单克隆细胞株;采用药物敏感的细胞株建立报告基因生物学活性测定方法,并对方法进行优化及验证。结果筛选出GLP-1-Fc活性检测细胞株293-GLP-1R/CRE,该细胞较合适的活性检测参数为每孔接种20 000个细胞,培养10～15 h,利拉鲁肽的起始浓度为10 mg/L,作用时间5 h。采用建立的方法检测不同效价利拉鲁肽样品相对生物学活性的回收率在(90. 43±3. 29)%～(99. 87±5. 34)%之间,利拉鲁肽(标准品)与样品6次测定的EC50的CV值分别为2%和3%,二者无差异。结论建立了快速、精确的测定GLP1-Fc生物学活性的方法,为GLP-1相关的药效指标评价提供了更加客观、全面的手段。     

人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体质控方法的建立

目的建立人源化抗表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体的质控方法。方法采用体外细胞生长抑制试验测定人源化抗EGFR单抗的生物学活性;质谱法和还原型SDS-PAGE法测定其准确相对分子质量;去封闭后用Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列;SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)法测定其纯度;反向液相色谱(RP-HPLC)法测定其肽图;定量PCR法和狭缝杂交法测定其外源性DNA残留量;其余项目按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果人源化抗EGFR单抗原液和成品的相对生物学活性分别为(100±20)%和(94±14)%;质谱法测得该单抗参考品轻、重链的相对分子质量分别为23 370.75和50 341.00,相对误差分别为0.005%和0.006%;还原型SDS-PAGE测得该单抗轻、重链的相对分子质量为27 000和53 400;轻、重链N-末端氨基酸序列均与理论一致;单抗原液的还原型SDS-PAGE纯度为98.5%;SEC-HPLC原液纯度为(98.39±0.05)%和成品SEC-HPLC纯度为(98.17±0.04)%;肽图图谱与理化参考品一致;定量PCR测得其外源DNA残留量小于100 pg/剂量;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求及其他相关要求。结论初步建立了人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体的质控方法,可用于该制品的常规质量控制。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体质控方法的建立

目的建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法。方法采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量。按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测。结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09～2.16)×106U/ml,比活性均大于3.5×105U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105U/mg。3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0%,RP-HPLC纯度均大于97.0%;经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000;样品原液的单链含量为75.7%;3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致;TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定。     

重组人干扰素α2a成品中蛋白含量体积排阻高效液相色谱法的建立

目的建立测定重组人干扰素α2a成品中干扰素α2a蛋白含量的体积排阻高效液相色谱法(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC),并进行验证。方法应用SE-HPLC法测定重组人干扰素α2a对照品及供试品蛋白质含量,并对方法的线性、精密度、稳定性、重复性及准确性进行验证。采用建立的SE-HPLC法检测5家企业生产的24批样品中干扰素α2a蛋白含量,同时每批样品按《中国药典》三部(2010版)方法测定生物学活性,并计算比活性(IU/mg)。结果重组人干扰素α2a在0.364 8～11.67μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.999 9)。用建立的方法连续进样6次,检测对照品溶液的干扰素α2a蛋白含量,RSD为2.4%;同一批样品进样12次,检测供试品溶液的干扰素α2a蛋白含量,RSD为2.8%;同一批样品取6份进样,检测供试品溶液的干扰素α2a蛋白含量,RSD为2.1%;5家企业生产的24批样品,平均加标回收率为103.5%,平均比活性为1.65×108IU/mg。结论建立了测定重组人干扰素α2a蛋白含量的SE-HPLC法,该方法简便,精密度、稳定性、重复性及准确性好,可用于重组人干扰素α2a成品中干扰素α2a蛋白含量的测定及比活性评价。     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质控方法和质量标准的建立

目的建立注射用重组葡激酶(staphylokinase,SAK)-水蛭素(hirudin,HV)融合蛋白(SFH)的质控方法和质量标准。方法采用纤维蛋白平板溶圈(fibrin agarose plate assay,FAPA)法测定SFH的溶栓比活性,纤维蛋白凝块溶解法测定SFH的抗凝比活性;还原型SDS-PAGE测定SFH的相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定SFH的纯度;胰酶裂解后采用RP-HPLC法分析SFH的肽图;其他各项指标的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果用建立的方法对SFH原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用SFH产品的常规检定。     

重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(rhRMcAb)的质控方法和质量标准。方法采用小鼠中和试验(MNT)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分别测定6批rhRMcAb样品的中和活性;还原、非还原SDS-PAGE检测rhRMcAb样品的纯度;还原烷基化胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法分析rhRMcAb的肽图;焦谷氨酸肽酶去除N-端焦谷氨酸封闭后,氨基酸序列分析仪测定rhRMcAb的N-端氨基酸序列;表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定rhRMcAb与狂犬病病毒糖蛋白的亲和常数;按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhRMcAb的各项其他指标,并建立其质量标准。结果采用MNT和RFFIT2种方法检测6批rhRMcAb的中和活性,批间活性基本一致;3批rhRMcAb原液的还原SDS-PAGE纯度大于99.0%,非还原SDS-PAGE除抗体主带外,在高、低相对分子质量处分别存在一些次带;3批原液样品的肽图图谱与理化测定对照品一致;N-端氨基酸序列与理论序列一致;结合狂犬病病毒糖蛋白抗原的亲和常数为1.86×108/M;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求;建立的质量标准中,中和活性应不低于500IU/mg,SDS-PAGE及HPLC纯度应不低于98.0%。结论已建立了rhRMcAb的质控方法和质量标准,可用于rhRMcAb产品的检定。     

聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体质控方法与质量标准的建立

目的建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的质控方法和质量标准。方法利用乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制试验测定重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的生物学活性;RP-HPLC和SECHPLC测定其纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;荧光定量PCR检测E.coli宿主DNA残留量;ELISA法测定宿主蛋白残留量;Edman降解法进行N-末端序列测定;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按《中国药典》三部(2010版)规定进行。同时对通常在原液中进行检定的宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定进行初步的方法验证,考察其在成品中进行检测的可行性。结果经初步验证,在成品中进行宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定具有可行性,用建立的方法对重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。同时只对成品进行质控的方法和质量标准对同类产品的质量控制具有借鉴意义。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA_(14-14-2))病毒原液及成品疫苗的稳定性观察

目的观察乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗(SA14-14-2)病毒原液及成品疫苗的稳定性。方法取3批乙脑减毒活疫苗病毒原液,分别于20～25、2～8、-18～-22及-38～-42℃储存,间隔一定时间取样,检测病毒滴度;将2～8、-18～-22及-38～-42℃储存的在观察末期符合规定的病毒原液制备成品疫苗,观察其于2～8℃储存的稳定性。结果3批疫苗病毒原液在20～25℃储存16h、2～8℃储存12d、-18～22℃冻存3个月及-38～-42℃冻存6个月,病毒滴度均符合《中国药典》三部(2005版)的要求;由2～8℃储存12d、-18～-22℃冻存3个月、-38～-42℃冻存6个月的病毒原液所制备的成品疫苗2～8℃储存24个月,病毒滴度下降缓慢,且热稳定性良好,符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论乙脑减毒活疫苗病毒原液的稳定性随温度的变化而变化,温度越低,稳定性越好;所制备的相应成品疫苗,在观察期内稳定性良好。     

毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗的稳定性

目的考察毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液和成品的稳定性。方法将3批疫苗原液置4℃存放,分别于0、1、2、3、6个月时取样,测定其在各时间点的乙型肝炎表面抗原S、前S1(PreS1)、前S2(PreS2)抗原滴度及HPLC纯度;将3批疫苗成品置25℃和4℃存放,进行加速稳定性和长期稳定性试验,分别于0、1、2、3、6个月和0、3、6、9、12、18、24个月时取样,进行小鼠效力、pH值、细菌内毒素和无菌测定。结果 3批疫苗原液于4℃保存6个月,表面抗原S、PreS1、PreS2抗原滴度及HPLC纯度均无明显变化;3批疫苗成品于25℃放置6个月和4℃放置24个月,各个时间点的小鼠效力均符合暂定规程的要求,pH值保持稳定,细菌内毒素和无菌试验均符合《中国药典》三部(2005和2010版)要求。结论毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液及成品稳定性良好。     

无明胶保护剂在麻疹风疹联合减毒活疫苗中的应用

目的研制一种安全有效的无明胶保护剂,并应用于麻疹风疹联合减毒活疫苗的制备。方法制备麻疹风疹联合减毒活疫苗原液,取同一批麻疹病毒原液,分别加入不同成分和配比的无明胶保护剂,制成成品,以含明胶保护剂作对照,检测成品外观、病毒滴度及水分,确定保护剂的成分,再确定保护剂的配比。将麻疹与风疹病毒原液混合,加入筛选出的无明胶保护剂,制备麻疹风疹联合减毒活疫苗(共3批),同时制备3批含明胶保护剂对照疫苗。按《中国药典》三部(2010版)要求对联合疫苗原液、半成品、成品进行检定;分别将制备的联合疫苗于2～8℃放置3和6个月,检测疫苗外观、病毒滴度及水分的变化,于37℃放置1、2、3、4周,检测病毒滴度的变化;按《中国药典》二部(2010版)要求进行过敏试验。结果含海藻糖和右旋糖酐成分的保护剂为首选保护剂。制备的无明胶保护剂联合疫苗原液、半成品及成品的各项检定指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求;无明胶保护剂联合疫苗成品于2～8℃放置6个月的水分和病毒滴度及37℃放置4周的病毒滴度与对照组疫苗相比,差异均无统计学意义(P>0.05);注射了无明胶保护剂联合疫苗的豚鼠在试验期内均未发生过敏反应,符合《中国药典》二部(2010版)的要求。结论无明胶保护剂对麻疹和风疹病毒具有较好的保护作用。     

人源化叶酸受体α抗体质控方法的建立

目的建立人源化叶酸受体α抗体的质控方法。方法应用基于表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术的BIAcore3000系统测定人源化叶酸受体α单抗与重组人叶酸受体α的亲和力,从而反映该抗体的功能;采用ELISA法测定其抗原结合力;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度;紫外分光光度法测定其蛋白含量;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;其他各项指标检测按《中国药典》三部(2005版)要求进行。结果人源化叶酸受体α单抗成品的平均相对百分效价为105%,RSD为6.0%。单抗成品及参考品与叶酸受体的结合力均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,其曲线相关系数在0.98以上,成品经3次测定,相对抗原结合力平均值为97%,RSD为25%。还原SDS-PAGE分析显示,单抗成品的IgG重链和轻链百分比为98.2%;非还原SDS-PAGE分析显示,完整IgG百分比为96.7%;SEC-HPLC分析显示,单抗成品单体为99.1%,聚合体为0.9%。其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论已初步建立了人源化叶酸受体α抗体的质控方法,为该制品的质量控制奠定了基础。     

重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性分析

目的评价近年重组人粒细胞集落刺激因子(Recombinant human grenulocyte colony-stimulatiny factor,rhG-CSF)的生物学活性及其检测方法的应用情况。方法采用mNFS-60细胞/MTT比色法对41批不同来源的rhG-CSF进行生物学活性检测,对中国食品药品检定研究院与各生产企业的检测结果进行比较,评价中国食品药品检定研究院检测rhG-CSF生物学活性结果的可信性。结果 37批国产rhG-CSF的生物学活性检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)质量要求,4批进口rhG-CSF的生物学活性均符合进口拟定质量标准(JS20070016)要求。中国食品药品检定研究院与各企业的rhG-CSF生物学活性检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论近年上市的rhG-CSF生物学活性达到《中国药典》三部(2010版)质量要求;该制品的生物学活性检测方法在全国范围内应用情况良好。     

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂质量控制研究

目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的质控方法和标准。方法采用黑色素瘤A375.S2细胞杀伤中和试验测定rhIL-1ra的生物学活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的质控方法对rhIL-1ra原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论建立的质控方法和标准可保证产品安全有效,可用于rhIL-1ra的检定。     

F基因型腮腺炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的质量稳定性分析

目的分析在细胞工厂上生产的F基因型腮腺炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的质量稳定性。方法将KMB17细胞在细胞工厂中传代,待细胞长为单层时,将腮腺炎病毒SP-A株按MOI 0.02接种于KMB17细胞,在细胞工厂上连续制备6批F基因型腮腺炎减毒活疫苗,对病毒收获液、原液、半成品和成品进行病毒滴度检测,其中成品还进行热稳定性试验及无菌检查、异常毒性检查、细菌内毒素、牛血清白蛋白残留量和抗生素残留量等检测。对检测数据进行统计学分析,对实验结果进行正态性检验,并绘制2倍标准差及3倍标准差质量控制图,进一步分析其质量稳定性。结果不同阶段产品的病毒滴度、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测值均符合正态分布,且在2倍标准差控制限范围内波动;无菌试验、异常毒性试验、细菌内毒素检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论利用细胞工厂在人二倍体细胞基质上制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的工艺,能持续稳定地获得有效性与安全性可靠的疫苗成品,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2015版)要求。本研究为F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化生产提供了实验依据。