猪β_2肾上腺素受体的表达、纯化及鉴定

研究了β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)基因重组表达质粒在人胚肾细胞293(Human embryonic kidney cells293,HEK293)中的瞬时转染及表达产物的纯化和鉴定。将已构建的重组表达质粒瞬时转染HEK293细胞,表达产物制备粗膜蛋白后,采用镍离子亲和层析法纯化得到受体蛋白并进行鉴定。结果表明:重组表达质粒p Tri Ex-1.1 Hygro-β2AR1-418转染HEK293细胞后表达量和蛋白活性较优,最佳表达时间为转染后72 h。SDS-PAGE和Western blot结果显示,在47 ku左右出现了特异性条带,咪唑的最佳洗脱浓度为250 mmol/L,受体蛋白纯度大于80%。活性鉴定表明:受体蛋白与HRP酶标记的3种β激动剂均能特异性结合,检测HRP-克伦特罗、HRP-莱克多巴胺和HRP-沙丁胺醇的OD值分别为0.97、0.91和0.94。通过纯化得到的受体蛋白,约占粗膜蛋白的4.4%。本试验成功获得一定数量纯度和活性较好的β2AR受体蛋白,为受体技术在β激动剂多残留检测中的研发和应用奠定了基础。     

人工表达β_2肾上腺素受体的β激动剂多残留检测

为提高人工表达的β_2肾上腺素受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)蛋白的活性并对其进行活性鉴定,利用分子对接技术将β_2AR与15种β受体激动剂进行柔性分子对接,依据筛选出的与β受体激动剂结合力较好的β_2AR分子结构,人工合成和改造β_2AR基因,构建重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),表达出具有活性的受体蛋白。SDS-PAGE鉴定结果显示,受体蛋白大小在47 ku左右。活性鉴定结果显示,与克伦特罗、莱克多巴胺及非诺特罗均能够特异性结合,OD值分别为0.45、0.32、0.36,受体蛋白与激动剂的结合力与其活性鉴定结果基本一致。标准检测曲线结果显示,受体蛋白对β受体激动剂类药物具有一定检测能力。利用分子对接技术,成功获得一定活性的β_2AR受体蛋白,为β_2AR在β受体激动剂多残留检测中的应用奠定了基础。     

麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin的克隆与表达

目的麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin可特异性结合麻痹性贝类毒素,本文采用杆状病毒表达载体系统对Saxiphilin进行体外表达研究。方法从牛蛙肝脏克隆得到ssziphilin基因(N端含有自身分泌信号肽),利用特异引物使其C端带上组氨酸标签。结果使用杆状病毒表达载体系统构建带有目的基因的重组病毒,用病毒感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞Sf9以表达Saxiphilin,通过优化细胞培养基中胎牛血清含量及感染时间,确定使用无血清培养基培养,重组病毒感染Sf9细胞72 h时,培养基中可溶性目的蛋白表达量最大。结论通过镍柱纯化得到Saxiphilin蛋白,以期将此蛋白进一步用于麻痹性贝类毒素的检测。     

β2肾上腺素受体基因的改造及在无细胞合成体系中的表达

依据大肠杆菌密码子偏好性,设计合成β2肾上腺素受体（β2 adrenergic receptor,β2AR）基因序列,应用大肠杆菌无细胞系统对其进行高效表达,经负载镍离子的顺磁颗粒MagneHis? Ni-Particles纯化后,对受体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和活性鉴定。结果表明：改造后的β2AR基因密码子适应指数（codon adaptation index,CAI）为0.96,GC含量从58%降低到46.17%,更有利于该基因在大肠杆菌系统中的表达。表达体系中优化后的Mg2＋浓度为22?mmol/L,此时表达量为1 250 μg/mL。SDS-PAGE分析显示,纯化蛋白在47?kDa左右出现清晰的特异性条带,与预期结果一致,纯度大于90%。直接酶受体分析检测结果显示,当纯化受体蛋白1∶500稀释包被时,该重组受体与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺的酶标记物结合的OD值分别为0.976、0.836和0.728,亲和活性依次降低。β2AR蛋白在无细胞体系中的成功表达,为研发基于受体的β激动剂多残留快速检测技术提供了理论支持。     

人体中可溶性VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

针对人体血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEG-FR-2)受体型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达,并对表达和纯化条件进行优化。构建表达VEGFR-2酪氨酸激酶重组大肠杆菌,通过研究不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和超声条件等对蛋白表达的影响,采用Ni-NTA亲和层析法、Western Blot法ELISA方法对重组蛋白进行纯化、鉴定和活性测定。成功地将1 000 bp左右的VEGFR-2酪氨酸激酶DNA片段插入载体pQE30中,在优化条件下重组蛋白较好地可溶性表达。SDS-PAGE表明重组蛋白相对分子质量约为36 000,与预期一致,Western Blot分析表明它能与抗Flk-1和抗His抗体特异反应,ELISA检测结果表明重组蛋白具有利用ATP催化底物磷酸化的激酶活性。通过重组DNA技术使人体VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌得到可溶性表达,纯化重组蛋白具有较高的活性。     

猪β_2肾上腺素受体基因克隆及重组酵母表达质粒的构建

克隆猪β2AR基因并进行序列分析,构建其重组酵母表达质粒。采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,经RT-PCR扩增、克隆及鉴定,获得猪β2AR的c DNA序列,并对该序列及编码的氨基酸序列进行分析。同时将目的基因插入p PICZαA酵母表达载体,构建重组表达质粒。克隆获得猪β2AR基因c DNA序列1257 bp,Genbank登录号为KF023571.1,编码418个氨基酸,蛋白分子质量46.73 ku。生物信息学分析表明,该基因与其他物种的β2AR基因相似性较高,均在83%以上,具有较高的同源性。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析,证明成功构建了重组酵母表达质粒p PICZαA-β2AR。本研究为猪β2AR基因在毕赤酵母系统的表达及建立基于受体的β激动剂多残留检测方法奠定了基础。     

禽蛋黄过敏原Gal d 6的重组表达、纯化鉴定

目的:建立表达蛋黄Gal d 6 重组蛋白工程菌,并鉴定重组Gal d6蛋白免疫活性。方法:直接合成Gal d 6 DNA,与pET-28a构建重组质粒,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达;优化表达条件制备重组Gal d 6蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到纯品蛋白;纯化Gal d6蛋白经间接ELISA及western blot鉴定Gal d 6蛋白免疫活性。结果:经DNA测序、SDS-PAGE、禽蛋过敏血清鉴定表达Gal d 6蛋白具有免疫活性,经镍柱亲和层析获得单一条带。该工程菌最佳表达条件为37 ℃,0.5 mmol/L IPTG,2 h,收获量每升菌液可收获重组蛋白约9.1 mg。重组蛋白与禽蛋过敏血清具有良好反应性。结论:建立稳定表达具有免疫活性的Gal d 6蛋白的工程菌株。     

人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I（h-GnT-I）的原核表达与活性鉴定

-β--N-乙酰葡糖胺转移酶I（-h-GnT-I）功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个-β--1,2 连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的-h-GnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1?驻TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-IΔTM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱（HPLC）检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42 800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。     

Ogataea minuta来源的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和纯化

在大肠杆菌中表达有活性的Ogataea minuta来源的内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EndoOm),利用p ET系统过量表达Endo-Om。在优化宿主菌及培养条件后,镍柱纯化目的蛋白质,并检测纯化后的Endo-Om对荧光标志的寡糖链的水解活性。经IPTG诱导后,目的蛋白质可以很好地表达,但大部分存在包涵体中。通过培养条件优化,16℃在Overnight ExpressTMInstant LB培养基(默克)中培养,实现了Endo-Om在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化,并检测到了纯酶的水解活性。在大肠杆菌中成功纯化了有活性的Endo-Om蛋白,为加速研究该酶的结构和功能奠定了基础。     

类芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中可溶性重组表达的优化

目的:β-葡萄糖苷酶在食品工业领域具有广泛的应用价值,但重组表达时容易形成无活性的包涵体。通过传统诱导条件优化无法完全解决包涵体积累问题,需探索新的策略。方法:从类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp)基因组中克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因bgl,构建到大肠杆菌表达载体p ET28a获得重组质粒p ET-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)获得重组菌BL-ETbgl,并进行诱导条件优化。进一步通过复制起始位点替换,构建了新型大肠杆菌表达载体p ACYT-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)后得到改进型重组菌BL-ATbgl。结果:BL-ETbgl经诱导表达后,所表达重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。经诱导条件优化后,仍有40%蛋白以包涵体存在。而BL-ATbgl经诱导表达后,可溶性的重组β-葡萄糖苷酶约占80%。自诱导培养基中β-葡萄糖苷酶产量可达2.31×106U/L。结论:通过降低质粒拷贝数、优化培养条件等手段,可以大幅度提高类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。     

金黄色葡萄球菌M型肠毒素原核表达、纯化、鉴定及溶液构象分析

葡萄球菌肠毒素M是由金黄色葡萄球菌νSa基因岛编码的分泌型超抗原。本研究将截去N端信号肽的金黄色葡萄球菌M型肠毒素(staphylococcal?enterotoxin?M,SEM)蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-ΔNspsem;随后转化感受态E.coli?Rosetta(DE3)并探讨融合蛋白最佳表达条件;利用Ni2+-Sepharose?4?Fast?Flow亲合层析纯化出His-ΔNsp SEM融合蛋白;经质谱鉴定,纯化的融合蛋白对SEM的氨基酸覆盖率达96.3%;凝血酶切除6×His标签肽后,圆二色谱分析表明ΔNsp SEM重组蛋白富含β-折叠(35%)和β-转角(21%)以及较少α-螺旋(16%)等二级结构;荧光发射谱揭示ΔNsp SEM在278?nm和295?nm波长处激发时具有相同的Trp发射峰(341?nm);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表明ΔNsp SEM重组蛋白表现出较高的热稳定性。研究结果表明重组蛋白SEM表达成功,纯化的ΔNsp SEM重组蛋白溶液构象紧密并具有接近天然状态的结构,这为深入研究SEM蛋白的结构与功能提供理论支持。     

花生过敏原Ara h 1蛋白的原核表达及致敏性分析

从花生中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到花生过敏原Ara h 1基因,构建pET-28a-Ara h 1表达载体,转入Rosetta（DE3）宿主表达菌中诱导产物表达,用镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为75 kDa,与预计相符;经质谱鉴定为Ara h 1蛋白。用BALB/c小鼠模型评价重组Ara h 1蛋白的致敏性结果显示,重组Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、Th2型细胞因子、组胺含量升高,空肠和肺组织发生病变,表明重组Ara h 1蛋白可以导致小鼠发生Th2型过敏反应,且有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性。同时RBL细胞模型结果显示重组Ara h 1蛋白还可导致RBL细胞脱颗粒,释放β-己糖苷酶,进一步表明重组Ara h 1蛋白具有致敏性。     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

家蚕杆状病毒表达系统研究进展

近年来家蚕杆状病毒表达系统在应用和优化等方面研究有了新进展。家蚕杆状病毒表达系统利用携带外源目的蛋白基因的重组杆状病毒对家蚕及其细胞系的高效感染能力,在感染后的家蚕体内或培养细胞中大量表达目的蛋白。家蚕作为一种外源蛋白表达载体,具有与哺乳动物细胞类似的翻译后修饰过程,其与核型多角体病毒的动态相互作用也一直是研究的热点。由于该系统潜在的巨大优势,为生产人类急需的蛋白质药物、基因工程疫苗和基因工程杀虫剂等提供了新的途径。     

GII.3型诺如病毒重组衣壳蛋白的表达和纯化鉴定

目的通过杆状病毒表达系统,获取高纯度GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆和多克隆抗体提供免疫原。方法将GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白基因片段修饰后插入p HTA表达载体中,经测序鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化到MAX Efficiency~DH10Bac~(TM)感受态细胞中,获取表达杆粒并转染SF9细胞,表达GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白。重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定。结果 SDS-PAGE和Western blot结果表达了分子量约为60 k Da的重组蛋白,动物试验表明重组蛋白具有较好的免疫原性,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆抗体和多克隆抗体、建立相应的免疫学检测方法奠定了基础。结论构建了GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白表达载体,并获得GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2(Autoinducer-2)奠定了基础。     

李斯特菌噬菌体裂解酶基因在大肠杆菌中的表达

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性致病菌,存在于多种环境中,造成牛奶、肉类、水产品等的食品安全问题。李斯特菌噬菌体编码的裂解酶能够特异性地裂解宿主细胞,释放胞内的子代噬菌体。本研究旨在构建李斯特菌噬菌体A500裂解酶的细胞壁结合结构域CBD500的异源表达系统,获得重组蛋白。首先通过体外扩增得到CBD500基因,克隆到表达载体p ET32a(+)中,转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)。阳性重组菌在30℃,0.1 mmol/L IPTG中诱导4 h后,以可溶形式表达分子质量约35 ku的重组蛋白。利用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,纯化产物质量浓度为0.62 mg/mL。间接ELISA试验证实,纯化的重组蛋白具有生物学活性,可用于进一步研究裂解酶的理化性质和作用机制。     

PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功. PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDSPAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31 000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。