人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。     

人iASPP全长CDS的分段扩增、克隆及鉴定

目的 最初报道的iASPP长度为351个氨基酸,但最近发现iASPP的全长应为828个氨基酸,为了探讨全长iASPP的功能,我们采取3分段扩增的策略克隆全长iASPP基因.方法 从HL-60细胞中提取总RNA、DNA,RT-PCR分段扩增目的基因,克隆至pMD19-T simple载体,测序,并亚克隆至pCDNA3.1载体.结果 重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-iASPP经测序,与GenBank上登陆的人iASPP cDNA(gi:60457962)序列完全一致.结论 成功构建了iASPP真核表达载体.     

人类肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达质粒的构建与临床意义

目的：为实现高表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)治疗前列腺癌,通过分子生物学技术构建TRAIL基因的真核表达质粒。方法：采用RT-PCR技术,从HL-60、Jurkat细胞mRNA中扩增出人类TRAIL基因序列,利用基因工程技术将其插入到真核表达载体pLXIN中获得重组质粒pLXIN-TRAIL,并进行酶切鉴定和DNA序列分析。结果：RT-PCR获得预期的扩增产物TRAIL884bp基因片段,成功构建pLXIN-TRAIL重组质粒,酶切鉴定及测序结果与预期相符。结论：重组克隆载体pLXIN-TRAIL构建成功。     

BPI_(23)-Fcγ1重组蛋白原核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定

目的构建 pBV- BPI600- Fcγ 1700重组表达载体，转化大肠杆菌 DH5α，诱导表达 BPI23- Fcγ 1抗菌重组蛋白。方法采用 RT- PCR技术，从 HL- 60细胞和正常人白细胞 mRNA中扩增编码 BPI23和 IgG1Fc（ Fcγ 1）的基因；通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体；转化感受态大肠杆菌 DH5α，通过温控诱导表达 BPI23- Fcγ 1重组蛋白；测定 BPI23- Fcγ 1重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果 (1)RT- PCR获得预期的扩增产物— BPI600bp和 Fcγ 1 700bp基因片段； (2)成功构建 pUC18- BPI180、 pUC18- BPI420和 pUC18- Fcγ 1700重组克隆载体， DNA测序结果与文献报道一致； (3)成功构建 pBV- BPI600- Fcγ 1700重组表达载体，酶切图谱分析与预期结果相符； (4)BPI23- Fcγ 1重组蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的 20％； (5)复性后重组蛋白具有抗菌活性和激活补体、介导调理吞噬等作用。结论 pBV- BPI600- Fcγ 1700重组表达载体构建成功，并在大肠杆菌中得到表达，获得具有 BPI和 IgGFc双重生物学活性的重组抗菌蛋白。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

含hTERT基因片段重组逆转录病毒的构建

目的构建含hTERT基因片段的重组逆转录病毒。方法采用RT-PCR法从人白血病细胞株K-562中扩增hTERT基因片段(1590~2540bp),亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN,构建重组质粒pLXSN-hTERT;用脂质体转染的方法将从重组质粒转入PT67细胞,G-418压力筛选获得含hTERT基因片段的重组逆转录病毒细胞克隆;0.22μm微孔过滤抗性克隆上清获得含表达hTERT基因的重组逆转录病毒;WesternBlot检测G-418抗性克隆的hTERT产物的表达。结果PCR扩增的hTERT基因片段与GenBank公布的序列相比仅有2个核苷酸差异,氨基酸序列完全一致;重组病毒的滴度为2.85×105PFU/ml;WesternBlot检测到含hTERT基因片段的重组病毒能够表达出一分子量为37kD的多肽。结论成功构建了表达hTERT基因片段的重组逆转录病毒,为进一步探讨内源性表达hTERT基因产物的树突状细胞能否激发特异性CTL的产生奠定了坚实的基础。     

人截断型LBP基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人N端截断型脂多糖结合蛋白（tLBP)基因的杆状病毒表达载体,为后续的蛋白表达及其抗内毒素保护作用研究奠定基础。方法 采用PCR技术从人全长LBP基因cDNA中扩增长度为695bp的基因片段,经pGEM-T载体亚克隆筛选和序列分析后,应用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统,基因重组和外源基因转座分别构建转移质粒pFASTBACtLBP和穿梭质粒pBac-midtLBP。结果 经PCR、琼脂糖凝胶电泳、酶切分析及序列测定,所克隆的基因片段为700bp左右的tLBP,并证实其目的基因重组载体发生了特异转座和病毒重组。结论 本实验成功克隆了tLBP目的基因片段并构建其杆状病毒表达载体。     

hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定

目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。     

粉尘螨Ⅱ类抗原(Der f 2)的cDNA克隆测序及亚克隆

目的 :获得粉尘螨Derf 2cDNA克隆及亚克隆 ,并进行测序。方法 :设计合成引物 ,从粉尘螨螨体中提取RNA ,经RT PCR获得cDNA ,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至 pMD 18T ,转化大肠杆菌E .coliJM 10 9,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序 ,将PCR筛检阳性重组子及 pET 3 2a( +)表达载体分别用SacⅠ和NotⅠ双酶切 ,连接转化至E .coliCompetentCellJM 10 9中过夜培养 ,挑选菌落进行酶切鉴定。结果 :从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf 2cDNA片段 ,成功构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚克隆 ,酶切产物的大小与预期相符。结论 :成功地对粉尘螨Derf 2cDNA进行体外扩增并构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚 克隆     

CONSTRUCTION，EXPRESSION AND BIOLOGICAL ASSESSMENT OF BPI23—Fcγ1 RECOMBINANT PROTEIN PROKARYOTIC EXPRESSION VECTOR

INTRODUCTIONGram－negativesepsis（GNS）andinfectiousshockarechallengestocliniciansbecauseofhighmortality（１）．Routineantibiotictherapydoesnotworkwellbe－causeoftheincreasingoccurrenceofresistantstrainsand（２）．Anti－lipopolysaccharide（LPS）monoclonal     

BPI23—Fcγ1重组蛋白核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定

目的：构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α,诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白;测定ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果：⑴ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＩ６００ｂｐ和Ｆｃγ１７００ｂｐ基因片段;⑵成功构建ｐＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ｐＵＣ１８－ＢＰＩ４２０和ｐＵＣ１８－Ｆｃγ１７００重组克隆载体,ＤＮＡ测序结果与文献报道一致;⑶成功构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,酶切图谱分析与预期结果相符;     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

SARS病毒S2蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)S2基因的原核和真核表达质粒,研究该真核表达重组质粒作为DNA疫苗的可行性.方法 采用RT-PCR技术从灭活的SARS冠状病毒RNA扩增得到SARS-CoV-S2基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1 中,构建pET-28a-SARS-CoV-S2和pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒.用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组质粒pET-28a-SARS-CoV-S2在大肠埃希菌BL21(DE3)plysS中表达融合蛋白;并将重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒免疫BALB/c小鼠,采用ELISA、Western blot的方法检测被免疫小鼠的抗体应答情况.结果 应用RT-PCR技术,从灭活的SARS冠状病毒扩增得到大小约为998 bp SARS-CoV-S2基因片段后,构建了含SARS-CoV-S2基因片段的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2和真核表达质粒pCDNA3.1-SARS-CoV-S2;通过IPTG诱导,重组pET-28a-SARS-CoV-S2质粒在表达菌BL21(DE3)plysS内表达S2融合蛋白;用纯化的重组真核表达质粒经基因枪免疫BALB/c小鼠后,获得了高效价的特异性抗体.结论 成功构建了可表达SARS-CoV-S2融合蛋白的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2.重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒可作为DNA疫苗使被免疫小鼠产生明显的免疫应答.为建立SARS特异性血清学诊断方法和研制SARS DNA疫苗奠定了一定的基础.     

重组BC047440蛋白的表达及其对人肝癌细胞系HepG2增殖的影响

目的 构建原核表达载体,制备重组BC047440蛋白并观察不同浓度的重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响.方法 提取肝癌组织总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440 cDNA,克隆入质粒pMD19-T,转化E.coli DH5α,酶切目的 基因片段,插入质粒pET-28a(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物,提取重组BC047440蛋白,MTT法和流式细胞术检测不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响,Western blot检测重组蛋白作用后HepG2细胞表达Ki67蛋白的变化.结果 克隆、鉴定BC047440基因,构建其原核表达载体,成功制备并纯化BC047440重组蛋白.1.0、10.0、20.0 μg/ml浓度重组BC047440蛋白分别作用HepG2细胞48 h后,细胞增殖率分别为124.0%、136.1%、126.6%,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).流式细胞术结果提示,对照组的细胞增殖常数(PI)为26.1, 重组蛋白处理组PI为48.6,二者差异具有统计学意义(P<0.05).重组BC047440蛋白作用HepG2细胞后,Ki67蛋白的相对表达量为(0.317±0.062),对照组的相对表达量为(0.177±0.037),二者差异具有统计学意义(P<0.05).结论 制备的重组BC047440蛋白具有直接促进HepG2细胞增殖和促进其表达Ki67蛋白的作用,可能是一种新的促进肝癌增殖蛋白.     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。