基因工程人干细胞因子原核表达、纯化及生物学活性研究

目的摸索一种适合于中试生产的重组人干细胞因子(recombinant human stem cellfactor,rhSCF)的发酵表达与纯化工艺.方法研究不同培养基和热诱导时间对rhSCF表达量影响;探索最佳纯化工艺和各因素对rhSCF得率和生物学活性的影响.结果rhSCF工程菌在含甘油、酪蛋白水解物、酵母浸出粉、胰蛋白胨及微量元素的培养基中表达量最高.灰度扫描显示热诱导后2 h开始表达,6 h表达量最高,目的蛋白约可达菌体总蛋白30%.高表达蛋白经复性后,可用酸沉淀作粗分离纯化,随后用阳离子交换层析分离,纯度达80%,经反相层析去除二聚体后,最后用DEAE柱浓缩后并经S200转换缓冲液,最终获得纯度＞95%和比活性＞6×105 U/mg的rhSCF制品.结论成功地建立了注射用rhSCF的中试生产工艺,为随后进行的临床前研究及临床试验奠定基础.     

癌-睾丸抗原GAGE-1基因的重组、表达及纯化

目的 为进一步研究临床应用癌-睾丸抗原GAGE-1诱导特异性抗肿瘤免疫反应,对GAGE-1基因进行克隆、体外原核重组表达及蛋白分离纯化。方法 运用RT-PCR技术从人QGY-7701肝癌细胞株中扩增GAGE-1基因片段,插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAGE-1,并导入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;经包涵体透析复性及GST柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析鉴定。结果 扩增得到GAGE-1基因5’端251 bp片段,与GeneBank公布的序列一致,构建的PGEX-6p-1-GAGE-1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约35.7 kD的GST-GAGE-1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%以上。结论 成功构建PGEX-6p-1-GAGE-1重组表达质粒,并成功表达纯化了GST-GAGE-1融合蛋白,为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础。     

死亡受体5胞外区域的重组、表达及活性鉴定

目的: 构建死亡受体5(death receptor 5,DR5)胞外区域(eDR5)的表达载体,表达纯化重组蛋白并鉴定其生物特性.方法: 通过重叠 PCR 获得 DR5 胞外段编码序列,构建 pET-22b( )/DR5 表达载体,转化大肠杆菌 BL21(DE3),IPTG 诱导表达,Ni2 柱亲和纯化,SDS-PAGE、直接 ELISA 鉴定纯化产物的纯度和特异性,用 MTT 法检测eDR5 蛋白阻断DR5 单克隆抗体 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343(高表达DR5)、U373(低表达DR5 )细胞凋亡的作用.结果: 获得了 DR5 胞外段编码序列,目的蛋白在上清及包涵体中都有表达, 表达量占菌体总蛋白的 30% 以上,纯化的重组蛋白纯度达 95% 以上,蛋白产量达 9 mg/ml.ELISA 结果表明所纯化蛋白为eDR5.eDR5 蛋白可部分阻断 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343 细胞凋亡的作用,其阻断率与 DR5 表达相关.结论: 死亡受体 5 胞外段基因的成功重组、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础.     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的：用基因工程方法获取重组人血小板因子4（rhPF4）,为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础。方法：PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET—PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS—PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白。结果：成功构建了表达载体pRSET—PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致。IPTG诱导表达的rh—PF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11％。亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84％。结论：获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的:用基因工程方法获取重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础.方法:PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白.结果:成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.结论:获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白.     

重组Prohibitin融合蛋白包涵体的纯化

[目的]获得高纯度具有免疫活性的Prohibitin融合蛋白.[方法]异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌BL21(pET30a( )-prohibitin)表达,其融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,用Ni-NTA Agarose亲和层析柱分离纯化.通过12%SDS-PAGE胶和Bradford法检测其纯度和目的蛋白含量,用ELISA对纯化后的蛋白进行鉴定.[结果]从融合蛋白包涵体中纯化到具有免疫活性的目的蛋白,其纯度达90%以上,含量约0.3mg/ml.[结论]建立了有效纯化融合蛋白包涵体的方法,为对Prohibitin进一步的结构和功能研究奠定基础.     

人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备

目的克隆表达重组人生存素,制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法用RT-PCR方法从培养的人白血病细胞株HL-60中克隆人生存素cDNA,克隆到原核表达载体pET32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,目的蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价,Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性。结果所克隆生存素cDNA序列与Genbank中序列完全一致,将其读码框插入原核表达载体pET32a(+)诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白,表达量占总菌体的30%,纯化后融合蛋白的纯度为95%,所制备的鼠抗血清的效价达1:1600,Western blotting证实其有较好的特异性,可以检测肿瘤细胞生存素的表达。结论我们已克隆并表达了人生存素基因,所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测。     

提高bFGF基因表达水平的策略及其表达产物的纯化工艺

目的通过在同一个表达载体pLX1上调整SD序列和ATG之间距离,以提高bFGF目的蛋白表达量。方法以Klenow和MungBeanNuclease通过增加2个及减少2个碱基调整SD序列和ATG之间距离,SDS-PAGE和Westernblot检测目的蛋白表达量,以高压液相疏水层析、凝胶过滤及肝素亲和层析纯化目的蛋白、MTT法进行活性测定。结果获得了重组质粒pLX2,pLX3,诱导后与表达质粒pLX1（7.78%）相比,表达量分别为8.03%,9.9%,经纯化后获得的bFGF纯度达98%,ED50为2.29ng/ml。结论调整SD序列和ATG之间距离可以增加目的基因的剂量,从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。     

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

 目的　正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法　将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果　成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论　 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。     

The medically important dematiaceous fungi and their identification

Dematiaceous fungi include a large group of organisms that are darkly pigmented (dark brown, olivaceous, or black). In most cases the pigment is melanin, and specifically, dihydroxynaphthalene melanin. The diseases produced include chromoblastomycosis, eumycotic mycetoma, and phaeohyphomycosis. Phaeohyphomycosis is a new classification for a diverse group of previously known entities grouped together on the basis of finding dematiaceous hyphal and/or yeast-like forms in tissue; tissue involvement may be superficial, cutaneous and corneal, subcutaneous, or systemic. Identification of these fungi is based mostly upon morphology. Important structures include annellides (Phaeoannellomyces, Exophiala), phialides (Phialophora, Wangiella), adelophialides (Phialemonium without collarettes, Lecythophora with collarettes), differentiation of conidiophores (Xylohypha versus Cladosporium) and conidial hilum, septation and germination (Bipolaris, Drechslera, Exserohilum). Useful laboratory tests include the 12% gelatin test (controversial), nitrate assimilation (W. dermatitidis is negative, most other species are positive), and determination of temperature maxima (especially 37 degrees C for E. jeanselmei, 40 degrees C for W. dermatitidis and B. spicifera, 42 degrees C for X. bantiana, and 45 degrees C for Dactylaria constricta var. gallopava and Scedosporium inflatum).     

Orale Langzeitbehandlung von Onychomykosen mit Ketoconazol

Zusammenfassung: An der Studie zur Wirksamkeit und Anwendungssicherheit von Ketoconazol nahmen 27 Männer im Alter von 20 bis 80 (Median: 57) Jahre, davon 18 mit Onychomykosen und 9 als KontroUen bei den Laborwertbestimmungen, teil. Während des ersten Behandlungsmonats erhielten je 9 Patienten 200 mg und 400 mg Ketoconazol täglich. Danach wurden beide Gruppen 6 Monate mit 200 mg/d weiterbehandelt. Die klinische Beurteilung sowie hämatologische, biochemische und Plasmaspiegeluntersu-chungen erfolgten mindestens monafich, mykologische Untersuchungen wurden vor Aufnahme und bei Beendigung der Therapie vorgenommen. Erne letzte klinische Unter-suchung erfolgte 1 Jahr nach Beginn der Studie. Nach 7 Monaten Behandlung wurden 23 von 30 Nägeln mit “gebessert” bis “stark gebessert” beurteilt, nach dem behandlungsfreien Intervall galt dies für 28 von 30 Nägeln. Die Plasmaspiegel waren mit 200 mg/d ausreichend und uber den Behandlungszeit-raum konstant. Dies spricht für gute orale Resorption und Abwesenheit von Enzyminduktion. Die Laborwerte zeigten im Vergleich zu den Kontrollen und den Werten vor Behandlung keine signifikanten Abweichungen, so daß myelo-, nephro- und hepatotoxische Wirkungen von 400 bzw. 200 mg/d ausgeschlossen werden können. Der Lipidhaushalt wurde nicht beeinfluat und es trat unter Therapie als Folge der Ketoconazolwirkung lediglich Lanosterin im Serum auf. Nach Beendigung der Therapie ging der Lanosteringehalt schnell zurück. Damit erweist sich Ketoconazol in den angewandten Dosen als ein gut verträgliches und zur Langzeitbehandlung von Onychomykosen geeignetes Antimykotikum. Summary: Twenty-seven males with a median age of 57 (range: 20 to 80) years took part in this study on the efficacy and safety of ketoconazole. Eighteen men suffered from onychomycosis; nine served as controls in the safety evaluation. During the first month of treatment, nine patients received 200 mg and the nine other 400 mg ketoconazole daily. Then the treatment was uniformly continued with 200 mg/d for 6 months. Clinical evaluation and haematological, biochemical and plasma level investigations were carried out at least at monthly intervals; mycological controls were performed at the start and end of therapy. A final clinical evaluation was carried out one year after the start of the study. After 7 months of treatment, moderate or definite clinical improvement was obtained in 23 out of 30 nails. After 5 more months without antimycotic treatment this was the case in 28 of 30 nails. Plasma levels obtained with 200 mg ketoconazole daily were adequate and constant during the entire treatment period. This indicates a good oral resorption as well as the absence of induction of hepatic enzymes. The laboratory values did not show significant deviations as compared with the controls or with the pretreatment values. This excludes myelo-, nephro- and hepatotoxic effects of 400 and 200 mg ketoconazole daily. The lipid metabolism was not influenced, the only difference was the occurrence of lanosterol in the serum, which is a result of the mechanism of action of ketoconazole. After the medication period the lanosterol levels subsided rapidly. In the applied doses ketoconazole is a well-tolerated and effective drug for the systemic long-term treatment of onychomycosis.     

裘法祖教授生平

Prof.Fazu Qiu,member of the Chinese Communist Party,surgery professor of Tongji Hospital,departed in Tongji Hospital,Wuhan,China,at fourteen to nine a.m,June 14,2008,after a disease.He turns 94 this year.He was the senior academician of the Academia Sinica,the illustrious medical scientist of China,and the Honorary Director of Tongji Medical College,as well as Huazhong University of Science & Technology.     

Dermatomycosis in Dogs

During the routine examination of dogs for cutaneous lesions, 205 dogs were screened for fungi other than dermatophytes. Twenty-two dogs (10.8%) revealed the presence of non-dermatophytic fungi suspicious for representing the etiologic agents of the skin lesions. The fungi isolated were Alternaria sp. (2.9%), Penicillium sp. (2.4%), Aspergillus fumigatus (2.0%), Mucor sp. (1.5%), Cladosporium sp. (1.5%) and Fusarium sp. (0.5%). No dermatophyte was isolated in association with these fungi. The incidence of these infections was found to be greater in warm and humid climate.     

Laboratory Techniques Alternative to In Vivo Experiments for Studying the Liberation, Penetration and Fungicidal Action of Topical Antimycotic Agents in the Skin, Including Ciclopiroxolamine

Summary: Short-term experiments on excised skin (human, pig) gave the following results: 1. In the tissue activity test with direct inoculation (D-TAT) commercial preparations of the non-azole antimycotics ciclopiroxolamine, tolnaftate and naftifine, produced higher inhibitory activity against Trichophyton mentagrophytes (standard strain) in various levels of the horny layer than were produced by the azole antimycotics econazole, miconazole, clotrimazole, oxiconazole and bifonazole. Fast drying solutions of antimycotics invariably gave higher inhibitory activities than creams. In the ultrafiltration tissue activity test (UFT- TAT) against Candida albicans (2 strains), antimycotic agents ranked in order of effectiveness as follows: ciclopiroxolamine – most of the azole antimycotics – bifonazole and naftifine. 2. In tests of fungicidal activity against T. mentagrophytes (2 strains) and Microsporum gypseum (1 strain) the first step was to inoculate the skin surface. After the horny layer had been penetrated by fungal mycelia, antimycotic agents of documented fungicidal potency, chiefly in the form of creams, were applied to the skin surface and left to act for up to 18 hours. The horny layer and epidermis were then scraped off and the concentration of viable fungi was determined. Ciclopiroxolamine cream and lotion produced by far the greatest diminution in viable fungi; creams containing oxiconazole and naftifine were moderately effective and those containing tioconazole and bifonazole produced a relatively small decrease in viable fungi. To avoid erroneous results it is important to homogenize and dilute the skin scrapings; if this is not done certain antimycotics will give misleadingly high fungal killing rates. At this early stage the scatter of results is still wide and minor differences in efficacy cannot as yet be detected with certainty. 3. From the results of various comparative tests it is evident that pig skin can be used as a substitute for human skin in the tests listed under 1. and 2. above. This discovery may make a valuable contribution towards limiting the need for experiments on living animals and trials on human beings. Zusammenfassung: In Kurzzeitversuchen an exzidierter Haut (Mensch, Schwein) wurde gefunden: 1. Im Gewebeaktivitätstest mit direkter Inokulation (D-GAT) wurde mit Handelspräparaten der Nichtazol-Antimykotika Ciclopiroxolamin, Tolnaftat und Naftifin in verschiedenen Hornschichtniveaus eine höhere Hemmaktivität gegenüber Trichophyton mentagrophytes (Standard-Stamm) erzielt als mit solchen der Azol-Antimykotika Econazol, Miconazol, Clotrimazol, Oxiconazol und Bifonazol. Rasch trocknende Lösungen von Antimykotika ergaben durchweg höhere Hemmaktivitäten als Cremes. Im Ultrafiltrations-Gewebeaktivitätstest (UFT-GAT) gegenüber Candida albicans (2 Stämme) ergab sich nach erzielter Wirksamkeit die Rangfolge Ciclopiroxolamine – Mehrzahl der Azolantimykotika – Bifonazol und Naftifin. 2. In Fungizidie-Testen gegenüber T. mentagrophytes (2 Stämme) und Microsporum gypseum (1 Stamm) wurde zunächst die Hautoberfläche inokuliert. Nach Durchdringung der Hornschicht mit Pilzmyzelien wirkten auf die Hautoberfläche bis zu 18 Stunden lang überwiegend Cremes von als fungizid publizierten Antimykotika ein. Während sich in abgeschabter Hornschicht und Epidermis der so bearbeiteten Hautoberflächen mit Ciclopiroxolamin-Creme und -Lotion die weitaus höchste Verminderung lebensfähiger Keime ergab, bewirkten Cremes mit Oxiconazol und Naftifin eine mittlere und solche mit Tioconazol und Bifonazol eine relativ niedrige Keimeliminierung. Zur Vermeidung von fehlerhaften Ergebuissen mußten Homogenisierung und Verdünnung der Hautschabsel erfolgen, anderenfalls bei mehreren Antimykotika eine zu hohe Keimabtötung vorgetäuscht worden wäre. Wegen der vorerst noch hohen Streuung der Ergebnisse können kleinere Wirksamkeitsunterschiede noch nicht sicher erfaßt werden. 3. Nach dem Ergebnis verschiedener Vergleichstests kann in den Testen zu 1. und 2. Schweinehaut als Ersatz für Haut vom Menschen dienen und dürfte damit wesentlich zur Einschränkung von Versuchen am lebenden Tier und von Prüfungen am Menschen beitragen.     

Oncogénétique et psycho-oncologie, une collaboration recommandée...

Résumé: La possibilité depuis 1994, de connaître la probabilité individuelle de développer certains cancers a permis de proposer de nouvelles modalités de prévention, de traitements et contribué au développement actuel de loncogénétique. Une meilleure connaissance des répercussions psychologiques tant pour les patients que pour les apparentés est désormais possible et limplication des psycho-oncologues dans ce cadre de la réalisation des tests prédictifs, recommandée. La mission de «messager» qui incombe au «cas-index» doit faire lobjet dune attention particulière. La complexité de linformation et la dimension paradoxale que peut avoir parfois la communication à propos des choix, rend difficile lévaluation de la qualité du consentement. La situation particulièrement délicate dune aide à la décision à légard de la chirurgie prophylactique, exige une collaboration étroite des généticiens et des psycho-oncologues.Les soins de support en oncologie     

The role of papillomaviruses in human cancers

This review comprehensively evaluates the influence of gene-gene, gene-environment and multiple interactions on the risk of colorectal cancer (CRC). Methods of studying these interactions and their limitations have been discussed herein. There is a need to develop biomarkers of exposure and of risk that are sensitive, specific, present in the pathway of the disease, and that have been clinically tested for routine use. The influence of inherited variation (polymorphism) in several genes has been discussed in this review; however, due to study limitations and confounders, it is difficult to conclude which ones are associated with the highest risk (either individually or in combination with environmental factors) to CRC. The majority of the sporadic cancer is believed to be due to modification of mutation risk by other genetic and/or environmental factors. Micronutrient deficiency may explain the association between low consumption of fruit/vegetables and CRC in human studies. Mitochondrial modulation by dietary factors influences the balance between cell renewal and death critical in colon mucosal homeostasis. Both genetic and epigenetic interactions are intricately dependent on each other, and collectively influence the process of colorectal tumorigenesis. The genetic and environmental interactions present a good prospect and a challenge for prevention strategies for CRC because they support the view that this highly prevalent cancer is preventable.     

Antifungal combination therapy in localized candidosis

A mouse model of localized candidosis in air-filled subcutaneous cysts imitating thrush has been developed. We have now tested various antifungal combinations in this animal model. Flucytosine (5-FC) + amphotericin B (Amph B) showed the highest efficacy, a clear additive or even synergistic effect was seen. The combination of 5-FC + imidazole or triazole derivative was less efficacious, an additive effect was rare. The combination of 5-FC + Amph B was also tested against Candida albicans strains showing various degrees of 5-FC-resistance. A significant reduction in 5-FC-resistant mutants was seen after the treatment with the combination.     

Les génériques en cancérologie: à molécule identique, médicaments identiques? Les biosimilaires, des super-génériques?

Résumé: Les biosimilaires vont bientôt voir leur apparition en Europe. Comment un laboratoire peut-il aborder le développement de son dossier dAMM? Quelles sont les bases légales et les recommandations officielles? Comment la similarité et/ou le caractère générique peuvent-ils être démontrés? Les règles sont-elles identiques à celles des produits chimiques conventionnels pour lesquels, notamment en cancérologie, il existe des médicaments génériques? Comment faire pour que la sécurité et lefficacité des médicaments biosimilaires soient assurées pour les patients?