SYBR(R) GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYB(R) Green Ⅰ实时PCR检测.以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限为19 CFU/ml.该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌.应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中inv A基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.     

SYBR~ GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBRGreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYBRRGreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高,检测低限为19CFUml。该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术,利用SYBRGreenI染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBRGreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法，根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物，进行SYBR GreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测；沙门菌不同群菌株做重现性检测；将沙门菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性，沙门菌属5个群菌株均为阳性：而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高，检测低限为19CFU／ml。该方法特异性强，重现性好，敏感性高，可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过熔解曲线可知其熔点值约为80，4℃，而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测.结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL.本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础.     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

以C.jejuni ORF-C基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测C.jejuni的方法。结果显示,对15株试验菌株进行荧光定量PCR检测,只有C.jejuni菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为11 CFU/m L,利用该检测方法对采集的60份样品进行检测,共计检出1份C.jejuni阳性样品,与国标法GB 4789.9—2014检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

传染性支气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

建立特异、敏感、快速的传染性支气管炎病毒(IBV)实时荧光定量PCR检测方法。针对IBV基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性的探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明所建立的IBV实时荧光定量PCR检测方法,引物和探针特异性良好,组间组内重复性良好,检出IBV DNA最小拷贝数为5拷贝。因此,本研究建立IBV特异、敏感、快速的实时荧光PCR检测方法,为IBV的诊断奠定基础。     

NDM-1基因TaqMAN实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据NDM-1序列,设计并合成了PCR检测引物(ND-T-F和ND-T-R)和探针(ND-T-PROBE),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,TaqMAN实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

采用实时荧光定量PCR法检测白酒酿造系统中的重要功能菌株Lactobacillus jinshani

金山乳杆菌(Lactobacillus jinshani)是1株广泛存在于白酒酿造体系中的功能菌株,为了快速、准确地对白酒酿造过程中的L.jinshani进行定性、定量检测,通过设计L.jinshani特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法.该研究根据白酒酿造菌株L.jinshani的全基因组序列设计了1对扩增产...     

NDM-1基因新型染料EverGreen实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据超级细菌NDM-1序列,设计并合成了检测引物(ND-E-F和ND-E-R),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了EVERGREEN实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,EverGreen实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

目的：为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌,建立实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。方法：根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针,借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证,并利用模拟样品对方法进行检验,最后对市售的实际样品进行检测。结果：该方法的特异性较好;方法的绝对灵敏度达到3pg,相对灵敏度达103 CFU/mL;重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。同时进行杂菌干扰实验,在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌,扩增均无明显影响,表明建立的方法抗干扰能力较好。利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线,得出R2为0.987,线性较好,可进行实际样品的检测。对市售的11 份样品进行检测,其中6 份含有嗜酸乳杆菌菌株,5份不含嗜酸乳杆菌菌株,标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×102～3.68×104 CFU/mL之间。结论：建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。     

食品中杏仁过敏原成分的检测

目的：建立检测食品中桃仁、杏仁过敏原成分的荧光PCR 方法,比较国外3 种ELISA 试剂盒效果。方法：针对杏仁Pru du1 基因设计引物及探针,建立荧光PCR 方法。利用杏仁过敏原参考物质对3 个品牌的ELISA试剂盒的回收率进行比较。结果：建立的荧光PCR 方法,具有很好的特异性;灵敏度为10mg/kg。结论：桃仁及杏仁过敏原成分荧光PCR 检测方法特异性好、灵敏度高,对食品中过敏原的检测有重要的实际意义。     

Real-time Polymerase Chain Reaction for the Food Microbiologist: Technologies, Applications, and Limitations

ABSTRACT: Rapid detection of pathogenic and spoilage microorganisms is essential for ensuring the safety and quality of food. Real-time polymerase chain reaction (PCR) technology has the potential to achieve rapid, sensitive, and specific detection of these microorganisms in food. In this review, we discuss real-time PCR technologies in use today, applications of real-time PCR in food systems, and some of the associated challenges and limitations.     

恒温隔绝式PCR快速检测蜡样芽孢杆菌方法的建立及应用

该研究以编码旋转酶B亚基的gyrB基因为靶基因,利用恒温热隔绝式PCR（Insulatedisothermal PCR,IiPCR）,建立一种快速检测蜡样芽孢杆菌的方法。同时,将建立的方法与聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）和实时荧光定量PCR（SYBER Green Ⅰ荧光染料法和TaqMan探针法）检测方法相比较,并应用于不同类型零售食品中的蜡样芽孢杆菌检测。结果表明建立的检测方法能在40 min内迅速判定出结果（+、-、？）;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌等均无交叉反应,显示出良好的特异性;方法的最低检出限为1.5×102 CFU/mL,优于普通PCR,与实时荧光定量PCR检出限相当;对42份零售食品进行检测,共发现45.23%的样本被蜡样芽胞杆菌污染（19/42）。这一结果与常规PCR检测结果一致,但检测时间至少节省了4 h以上。该研究为蜡样芽孢杆菌提供了一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高、适用于现场实时检测的检测方法。     

TaqMan探针法实时荧光定量PCR快速检测沙门菌的探讨

为建立一种快速、灵敏、特异的实时荧光定量PCR法用于沙门菌的检验，根据GenBank上登录的编号为AE016841的沙门菌序列，应用生物学软件在fimY基因的保守区设计引物和TaqMan探针，同时应用BLAST程序进行网上序列比对，并进行筛选、优化。用鼠伤寒标准菌和60份食品样本进行本检测方法的特异性、敏感性和重复性试验，并与常规法和科玛嘉平板分离法做比较。本方法对沙门菌的检测具高度的特异性，检测的灵敏度这102CFU／ml，从增菌至完成检测仅需24h左右，是一种快速检测沙门菌的敏感、特异的新方法。     

基于cgcA基因实时荧光PCR快速检测穆汀斯克罗诺杆菌的研究

为实现奶粉中常见污染菌穆汀斯克罗诺杆菌的快速检测与控制,本文根据cgcA基因序列设计出特异性探针和引物,建立了运用实时荧光定量PCR法检测穆汀斯克罗诺杆菌的反应体系和反应条件,并对该法的特异性、灵敏度、稳定性进行评价,并进行人工染菌样品检测实验。特异性结果表明,对穆汀斯克罗诺杆菌的荧光PCR检测结果的特异性为100%;灵敏度结果表明,穆汀斯克罗诺杆菌检出限在440 cfu/m L;稳定性结果表明,穆汀斯克罗诺杆菌组内实验CV在0.48~0.69%之间波动,而组间实验CV在0.69~0.73%之间波动;人工染菌样品试验表明,在增菌6 h后能检出阳性。本研究所建立的实时荧光定量PCR法特异性好、灵敏度高、稳定性强,有望成为快速检测食品中穆汀斯克罗诺杆菌污染的新方法,具有很好的研究价值和应用前景。     

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。     

BAX Q7系统快速检测食品中金黄色葡萄球菌效果验证

目的验证BAX Q7全自动病原菌检测系统快速检测食品中金黄色葡萄球菌的效果,以强化食品检验机构对金黄色葡萄球菌的快速检测能力和推进快速检测技术的有效应用。方法通过BAX Q7全自动病原菌检测系统和GB 4789.10-2010《食品安全国家标准-食品微生物学检验-金黄色葡萄球菌检验》2种方法同步检测定量污染的样品,比较2种方法的检测结果的符合率和灵敏度。结果采用2种方法对24份样本检测的结果基本一致,金黄色葡萄球菌检测符合率均为100%,但BAX Q7实时荧光定量PCR法相比国家标准方法检出时间缩短4～6 h,具有更高的灵敏度,而且操作简便快速。结论 BAX Q7实时荧光定量PCR系统能在食品安全突发事件中快速锁定病原菌,为溯源调查指明方向,应用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测合理可行。     

通用型酵母菌实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测鉴定食品中酵母污染菌实时荧光PCR法,根据酵母基因序列设计出通用型探针和引物,建立了运用实时荧光PCR法检测酵母的反应体系和反应条件,进而对该方法进行特异性验证,灵敏度分析及稳定性评价,并应用于产品样本的检测。特异性试验表明,酵母菌检测结果均为阳性,而细菌、霉菌均为阴性,荧光PCR检测结果的特异性为100%。灵敏度试验表明,酵母菌检出限在760 cfu/m L。稳定性试验表明,酵母菌组内实验CV在0.62~0.81%之间波动,而组间实验在0.43~0.77%之间波动。通过样品增菌检测发现在培养12 h后能检出阳性。本研究所建立的实时荧光PCR法特异性好、灵敏度高、稳定性好,具有快速、简便的特点,为快速检测食品中酵母污染提供新的方法和途径,具有很好的研究价值和应用前景。     

Rapid detection of Salmonella in pet food: design and evaluation of integrated methods based on real-time PCR detection

Reducing the risk of Salmonella contamination in pet food is critical for both companion animals and humans, and its importance is reflected by the substantial increase in the demand for pathogen testing. Accurate and rapid detection of foodborne pathogens improves food safety, protects the public health, and benefits food producers by assuring product quality while facilitating product release in a timely manner. Traditional culture-based methods for Salmonella screening are laborious and can take 5 to 7 days to obtain definitive results. In this study, we developed two methods for the detection of low levels of Salmonella in pet food using real-time PCR: (i) detection of Salmonella in 25 g of dried pet food in less than 14 h with an automated magnetic bead-based nucleic acid extraction method and (ii) detection of Salmonella in 375 g of composite dry pet food matrix in less than 24 h with a manual centrifugation-based nucleic acid preparation method. Both methods included a preclarification step using a novel protocol that removes food matrix-associated debris and PCR inhibitors and improves the sensitivity of detection. Validation studies revealed no significant differences between the two real-time PCR methods and the standard U.S. Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual (chapter 5) culture confirmation method.     

Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d~7 d缩短为仅需2 h~3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。