玉米细菌性枯萎病菌EGase内切葡聚糖酶蛋白纯化研究初探

目的研究玉米细菌性枯萎病菌EGase内切葡聚糖酶蛋白纯化的方法。方法以玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)菌株为材料,分离纯化其内切葡聚糖酶Egase。制备EGase浓缩液,浓缩液经Sephradex~(TM)G-75凝胶过滤层析和DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换柱层析等提纯步骤,获得了凝胶电泳均一的内切葡聚糖酶。结果经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条电泳带,纯化后的EGase是单体蛋白,分子量约为72.3 k Da。Egase酶反应的最适温度是60℃,最适pH为5.0。结论本研究从玉米细菌性枯萎病菌中分离得到了一种新的内切葡聚合糖酶,对其部分性质进行了表述,为后续EGase基因的克隆及表达研究提供了研究基础。     

番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术

目的 建立番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法。方法 应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对番茄溃疡病菌的16S rRNA特异性基因进行扩增, 采用4对引物识别目的片段的6个特异性区域, 62 ℃恒温1 h完成扩增。结果 设计的引物与对照菌皱纹假单胞菌、茄假单胞菌、丁香假单胞菌番茄致病变种都没有扩增反应, 表现了较好的特异性。这些对照菌在茄科蔬菜上易引起类似症状。结论 LAMP检测程序便捷, 所需设备简单, 其结果可以通过肉眼观察来判断, 比常规PCR灵敏且能更早得到反应结果, 因此该技术具有更大的优势。     

入境马蹄莲细菌性软腐病菌的分离鉴定

目的在参展青岛世界园艺博览会的荷兰进口马蹄莲植株上,发现叶片有明显褐色软腐症状,为明确引起马蹄莲软腐病的病原,对叶片进行病菌的分离鉴定。方法采用组织分离法,从荷兰入境马蹄莲植株的病变叶片中分离纯化到2株致病性细菌菌株(MTL1、MTL2),对该菌株进行鉴定和生物学特性研究。结果形态及培养特征、生理生化特性的研究结果表明该菌株在NA培养基上能形成白色圆形单菌落,薄而平滑、边缘整齐,光滑不透明,KB培养基上划线培养后可产生明显的绿色的荧光。显微镜下菌体呈杆状,具多根极生鞭毛,革兰氏阴性菌。结论经形态鉴定、培养特征、生理生化及16S r DNA序列分析和致病性测定实验,确认引起马蹄莲细菌性软腐病的病原为边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)。     

NDM-1基因新型染料EverGreen实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据超级细菌NDM-1序列,设计并合成了检测引物(ND-E-F和ND-E-R),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了EVERGREEN实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,EverGreen实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

木薯细菌性萎蔫病菌dnaA基因质粒标准样品的构建

目的构建木薯细菌性萎蔫病菌dna A基因质粒标准样品。方法以木薯细菌性萎蔫病菌染色体复制起始因子dna A特异基因序列为靶标设计引物,通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,构建木薯细菌性萎蔫病菌dna A基因片段的重组质粒。采用Pico Green DNA分子荧光定量方法对该质粒分子进行定值,对均匀性、稳定性及标准值进行研究,制备木薯细菌性萎蔫病菌dna A基因质粒标准样品。结果结果表明,木薯细菌性萎蔫病菌质粒标准样品定值为4.99μg/m L,可在-18~-20℃低温条件下长时间保存,在夏季高温期间一周内也可实现传输。结论该标准样品的研制解决了木薯细菌性萎蔫病菌的溯源参照物问题,为快速检测木薯细菌性萎蔫病菌奠定了基础。     

进境多肉植物细菌性褐腐病的病原分离与鉴定

目的通过对病变叶片进行细菌的分离鉴定,明确韩国进境多肉植物上叶片褐色腐烂病斑的病原。方法采用组织分离法,从韩国进境多肉植物叶片中分离纯化到1株细菌菌株,对该菌株进行了鉴定和生物学特性研究。结果形态及培养特征、生理生化特性的研究结果表明该菌株在营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基上单菌落圆形淡黄色,边缘整齐。菌体直杆状,周生鞭毛运动,无芽孢,为革兰氏阴性菌。经形态鉴定、培养特征、生理生化、致病性测定及16S rDNA序列分析,确认引起该多肉植物发生褐腐病的病原是菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。结论经过对发生细菌性褐腐病的叶片进行病原分离与鉴定,有效阻止了菠萝泛菌的远距离传播。     

番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法

目的建立番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法。方法应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对番茄溃疡病菌的16SrRNA特异性基因进行扩增,采用4对引物识别目的片段的6个特异性区域,62℃恒温1h完成扩增。结果设计的引物与对照菌皱纹假单胞菌、茄假单胞菌、丁香假单胞菌番茄致病变种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。这些对照菌在茄科蔬菜上易引起类似症状。结论 LAMP检测程序便捷,所需设备简单,其结果可以通过肉眼观察来判断,比常规PCR灵敏且能更早得到反应结果,因此该技术具有更大的优势。     

入境动物产品携带杂草疫情分析

系统分析2011~2015年山东口岸进境动物产品中杂草疫情的截获情况,旨在掌握进境动物产品中杂草截获的种类和规律,并有针对性地提出完善检疫监管措施的对策。共截获2407批次的杂草,其中检疫性杂草3科10属30种(属)52批次。按照来源国统计,从来自26个国家和地区的动物产品中截获杂草,其中以澳大利亚截获杂草批次和种次数最多,占到整个截获量的57.2%。根据以上情况分析,应加强进境动物产品中皮、毛的检疫力度。建议从风险评估、产地预检、检疫监管和处理、疫情监测、加强宣传沟通等多方面制定措施,建立外来杂草入侵防范体系,以有效防止外来有害杂草随寄主携带入侵我国。     

旅邮检口岸截获杂草疫情分析及防控

目的研究旅邮检口岸截获杂草的疫情现状,探讨防控杂草疫情扩散传播的有效措施。方法统计2011～2015年旅邮检口岸截获杂草的种属类别、频次高低以及来源分布地区和年度截获量的数据信息,分析杂草疫情风险。结果部分体积小、重量轻、带附属结构的杂草种类较易扩散传播,这些入侵的外来杂草能够对生态环境及农业安全生产带来危害。杂草来源地区分布较广,但来源于周边国家和地区的频次较高,年度截获杂草总量呈现逐年递增的趋势。结论旅邮检口岸通过引入先进的智能检测设备并且提升查验人员的专业素质,可以有效减少外来入侵杂草通过口岸入境的数量;通过加强法制宣传结合行政处罚的方式能够有效控制人为因素造成的疫情传播。这些措施能够防止疫情通过旅邮检口岸扩散传播到国内。