鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株91001的全基因组序列,并通过比较基因组学研究,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定91001菌株的全基因组序列,利用比较基因组方法对91001与另外2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 91001菌株的基因组包括1条染色体和4个质粒(pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为9609bp,与参考菌株基本一致;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒,长度为70159bp,编码情况与参考菌株基本相同,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异;pMT1质粒长度为106642bp,保留了较多的原始质粒片段,毒力相关基因与参考菌株没有差异;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒,在国内外研究中未曾报道,这一质粒长度为21742bp,具有独立复制能力,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。91001菌株的染色体长度为4595065bp,有4037个编码序列(CDS),其中141个是假基因;染色体中存在着非常丰富的插入序列,由于存在IS序列介导的基因组重排,91001菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析,初步确定了91001菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉伯糖分解代谢阴性以及蜜二糖分解阳性的遗传基础。结论 根据质粒结构、染色体基因组重排、硝酸盐还原阴性的机制以及假基因的分布等信息,推测以91001菌株为代表的田鼠型菌株是原始鼠疫耶尔森菌进化过程中的另一个分支,与现有菌株存在着比较明显的差异;而91001菌株独特的致病性可能与基因组中的假基因或大片段缺失有关。     

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对36株鼠疫耶尔森菌和7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析,鉴定差异区段(DFR),并对260株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出22个DFR,基于DFR图谱,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有21个基因组岛,其中18个已存在于假结核杆菌中,余下3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统;建立了各基因组型别间的系统发育关系,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系,基本探明了鼠疫耶尔森菌在中国的演化规律。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型--田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变,所有甘油利用阴性菌株的glpD基因发生了突变,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型——田鼠型;相应糖醇代谢相关基因发生突变是4个生物型变异的遗传基础。     

1994年印度苏拉特鼠疫暴发的回顾性基因溯源研究

目的 明确1994年苏拉特鼠疫疫情中分离的鼠疫耶尔森菌系统发育地位及基因组特征,为进一步研究此次疫情暴发的起因提供线索.方法 利用比较基因组学方法,将已发表的两株苏拉特暴发株基因组与366个鼠疫全球代表菌株的基因组进行变异鉴定和系统发育重建,并对苏拉特菌株的基因组特征进行解析.结果 苏拉特鼠疫菌很可能是20世纪广泛使用的鼠疫减毒活疫苗株EV76的后代.但两株苏拉特基因组中均存在长度为102 kb的毒力岛(称作pgm位点),该毒力岛在其他已知的EV76疫苗及实验室保藏株中缺失.结论 引发1994年苏拉特疫情的菌株属于鼠疫菌EV76种系,其引发疫情的能力可能与携带pgm位点有关.     

鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析

目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出4005条鼠疫耶尔森菌基因,PCR扩增各基因,以纯化的PCR产物点样制备芯片,采用双色荧光杂交策略,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。结论 成功建立了基于全基因组DNA芯片的鼠疫耶尔森菌比较基因组学技术平台。     

鼠疫耶尔森菌201株和201△pCD1株蛋白表达谱比较研究

目的：分析缺失编码Ⅲ型分泌系统的大质粒pCD1对鼠疫耶尔森菌蛋白质表达谱的影响,探索鼠疫菌的潜在致病机制,为鼠疫疫苗研制提供新线索。方法通过双向电泳与质谱分析相结合的方法,比较鼠疫菌在26℃和37℃不同培养温度下,全菌蛋白表达谱差异,鉴定差异蛋白并对其功能进行初步分析。结果成功分离并鉴定了鼠疫菌201株和201△pCD1缺失突变株中的差异蛋白,其中26℃条件下鉴定到24个差异蛋白,37℃条件下鉴定到25个差异蛋白,内含7个由pCD1质粒编码的蛋白。结论通过比较蛋白质组学研究,发现大质粒pCD1缺失后,多种染色体编码蛋白的丰度发生了显著变化,暗示大质粒能调控染色体编码基因的表达。     

鼠疫耶尔森菌重组酶聚合酶核酸扩增荧光检测方法的建立

目的 建立一种简单,快速的重组酶聚合酶核酸扩增技术检测鼠疫耶尔森氏菌的方法.方法 基于耶尔森氏菌的特异性序列设计引物及探针;通过对不同温度的检测来优化反应温度;通过对不同菌株的DNA模板进行检测评价该方法的特异性;通过对不同稀释浓度的样本DNA模板进行检测来确定灵敏性;通过模拟样品进行应用评价.结果 基于鼠疫耶尔森菌的...     

鼠疫耶尔森菌吸入感染动物模型研究进展

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌感染引起的烈性传染病.在鼠疫已知的三种临床分型中,以气溶胶形式传播的肺鼠疫最为致命.开展肺鼠疫致病机制与防治研究需要稳定可靠的鼠疫耶尔森菌吸入感染动物模型.有报道构建鼠疫耶尔森菌吸入感染动物模型的攻毒方式多种多样,不同攻毒方式下建立的各种肺鼠疫动物模型展现出不同的特点.该文综述了鼠疫耶尔森菌吸入感染动物模型的研究进展.     

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）Ⅲ型分泌系统（T3SS）相关蛋白β-内酰胺酶（TEM-1β-lactamases,Bla）报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内。方法将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫菌研究的TEM报告基因载体。把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达。将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2 h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能。本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础。     

小鼠吸入性鼠疫病理学和毒力相关基因的体内转录

目的探讨吸入感染鼠疫的发生、发展过程及重要鼠疫菌致病相关基因的体内表达规律。方法采用滴鼻法建立小鼠吸入性鼠疫感染模型，并观察不同感染时间的组织病理学改变；采用免疫组化和逆转录一实时定量PCR方法检测感染小鼠组织中鼠疫菌5种毒力相关蛋白及其基因（cafl、lcrV、lcrG、pla、psaA）的表达和转录。结果鼠疫菌吸入后可诱导小鼠产生肺鼠疫型和非肺鼠疫型鼠疫。在小鼠体内感染状态下的鼠疫菌体表面能够检测到上述5种毒力相关蛋白的表达。其毒力基因的转录呈时相、组织差异性。结论在体内感染状态下，5种毒力相关蛋白均呈菌体表面可检测到的表达；各毒力相关基因在不同时间、不同组织中转录具有很大的差异性，这种差异性可能与其功能及宿主细胞的作用密切相关。     

基于Luminex悬浮芯片的鼠疫耶尔森菌SNP分型方法研究

目的利用Luminex悬浮芯片技术,基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）建立我国鼠疫耶尔森菌东方型菌株（以下简称东方型鼠疫菌）的基因分型方法,为进一步研究东方型鼠疫菌多态性并分析其系统发育关系奠定基础。方法利用多重PCR,同时扩增东方型鼠疫菌中18个具有分型意义的SNP位点,扩增产物进行多重等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE）反应以及Luminex悬浮芯片技术分析,随后利用MasterPlex GT V2.3软件计算平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）比值,判断各SNP位点的碱基状态;并对SNP分型方法的重现性进行评价。结果 Luminex多重SNP技术能够快速、高通量地检测出各SNP位点的MFI值,从而在8 h内一次性成功确定东方型鼠疫菌中18个SNP的碱基状态;36株东方型鼠疫菌基于18个SNP可以分为7个基因型。结论本文建立的Luminex多重SNP检测方法作为一种高通量检测SNP的技术平台,为后期的东方型鼠疫菌SNP分型及系统发育分析奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的：研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异，为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法：通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果：与已测序的3株鼠疫菌基因组进行同源性比较，发现了259个假结核菌基因组中存在的特异序列，与基因库进行同源性比较发现了10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论：抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法，鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因，假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。     

A real-time PCR-based amelogenin Y allele dropout assessment model in gender typing of degraded DNA samples

Allelic dropout due to stochastic variation in degraded small quantity DNA appears to be one of the most serious genotyping errors. Most methods require PCR replication to address this problem. The small amounts of valuable samples are often a limitation for such replications. We report a real-time PCR-based amelogonin Y (AMELY) allele dropout estimation model in an AMEL-based gender typing. We examined 915 replicates of AMELY-positive modern male DNA with varying amounts of DNA and humic acid. A male-specific AMEL fragment (AMELy) dropped out in 143 genuine male replicates, leading to gender typing errors. By graphing a scatter plot of the crossing point versus the end cycle fluorescence of the male replicates, a standard graph model for the estimation of the AMELy allele dropout was constructed with the dropout-prone and dropout-free zones. This model was then applied to ancient DNA (aDNA) samples. Nine samples identified as female were found in the dropout-prone zone; with higher DNA concentrations, six were shifted to the dropout-free zone. Among them, two female identifications were converted to male. All the aDNA gender was confirmed by sex-determination region Y marker amplification. Our data suggest that this model could be a basic approach for securing AMELy allele dropout-safe data from the stochastic variation of degraded inhibitory DNA samples.     

人肝癌细胞敲低Rab27 B后的差异蛋白质组初步研究

目的：通过分析敲低Rab27B后肝癌细胞蛋白质表达的变化,研究其在肿瘤细胞中的作用及可能的分子机制。方法在人肝癌细胞系MHCC97H中利用Tet-on系统和RNA干扰（RNAi）技术敲低Rab27B 表达,利用iTRAQ定量蛋白质组学技术比较敲低前后肿瘤细胞蛋白表达的差异,并对其进行亚细胞定位、生物过程和分子功能等生物信息学分析。结果 MHCC97H细胞敲低Rab27B后共鉴定到448种差异蛋白[比值（｜Ratio｜）＞1．21, P＜0．05],其中表达趋势与Rab27B正相关的蛋白229种,负相关的蛋白219种。差异蛋白主要涉及囊泡运输、大分子定位、胞内应激等生物过程,有26种差异蛋白分布于8个肿瘤相关信号通路中,其中11种集中在黏着斑（ focal adhesion）信号通路。结论对Rab27B敲低前后MHCC97H细胞全蛋白的iTRAQ分析表明,Rab27B不仅能影响肿瘤细胞的外泌体分泌,还能引起与细胞增殖和迁移等相关的信号通路中重要蛋白的变化,提示Rab27B确实具有调控肿瘤细胞增殖和迁移的分子基础。     

温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控研究

目的研究温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控作用。方法首先设计相关跨基因引物,用RT-PCR方法验证psa位点的相关操纵子结构。扩增操纵子首基因上游启动子区500 nt序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,将重组质粒转入鼠疫菌中,通过测定β-半乳糖苷酶活性差异来判断不同温度（26和37℃）和酸度（pH 6.0和pH 8.0）对psaE和psaA的调控关系。最后提取鼠疫菌在上述不同温度和酸度条件下的总RNA,采用引物延伸实验进一步明确温度和酸度对psaA的调控关系。结果与结论 RT-PCR结果证实了田鼠型鼠疫菌的psa位点由操纵子psaEF和psaABC构成;半乳糖苷酶和引物延伸实验结果显示在37℃、pH 6.0培养条件下psaABC的转录水平最高,而psaEF的转录水平无明显变化,提示psaA的表达水平在37℃酸性条件下表达量最高,psaE则不受温度和酸度的调控。