不同培养条件下鼠疫菌PhoP/PhoQ的自调控模式研究

目的 研究鼠疫耶尔森菌PhoP/PhoQ在不同培养条件下的自调控关系.方法 PCR扩增YPO1635启动子区DNA序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,进而将该重组质粒转入鼠疫菌野生株(WT)和phoP突变株(ΔphoP)中,通过测定二者中β-半乳糖苷酶活性差异来判定PhoP对YPO1635的调控关系.提取WT和ΔphoP的总RNA,采用引物延伸实验研究phoP的转录起始位点,并根据产物的丰度判断PhoP对phoP的调控关系.结果 LacZ结果表明,在低Mg2+TMH和BHI培养基中,PhoP能激活YPO1635的转录,而在高Mg2+TMH中,PhoP对YPO1635的转录无调控作用.引物延伸结果显示,phoP有两个转录起始位点G(-90)和A(-118)(分别记为P1和P2,翻译起始位点为+1),在低Mg2+ TMH中,PhoP能激活P1的转录,而对P2无调控作用;在高Mg2+TMH中,PhoP对二者均无调控作用;在BHI中,PhoP对二者的转录均具抑制作用.结论 PhoP/PhoQ的自调控关系随周围环境的变化而表现出不同的模式,这有利于鼠疫菌快速适应外界生存环境的改变.     

拟核结合蛋白H-NS调控副溶血弧菌vp1667的转录

目的 研究副溶血弧菌H-NS对vp1667的转录调控机制.方法 提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对vp1667的转录调控关系;采用引物延伸实验研究vp1667的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对vp1667的调控关系;将vp1667的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入Δhns和WT中获得LacZ菌株.通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对vp1667的调控关系.PCR扩增vp1667的启动子区序列并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS对vp1667启动子区是否具有直接的结合作用;采用DNaseⅠ足迹实验研究His-H-NS对vp1667启动子区的具体结合位点.结果与结论 引物延伸结果显示,vp1667只有一个转录起始位点T(-28)(翻译起始位点为+1),且其转录活性受H-NS的抑制;EMSA和DNaseⅠ足迹实验结果显示,His-H-NS不能结合到vp1667的启动子区,表明H-NS只能间接抑制vp1667的转录.     

鼠疫耶尔森菌201株和201△pCD1株蛋白表达谱比较研究

目的：分析缺失编码Ⅲ型分泌系统的大质粒pCD1对鼠疫耶尔森菌蛋白质表达谱的影响,探索鼠疫菌的潜在致病机制,为鼠疫疫苗研制提供新线索。方法通过双向电泳与质谱分析相结合的方法,比较鼠疫菌在26℃和37℃不同培养温度下,全菌蛋白表达谱差异,鉴定差异蛋白并对其功能进行初步分析。结果成功分离并鉴定了鼠疫菌201株和201△pCD1缺失突变株中的差异蛋白,其中26℃条件下鉴定到24个差异蛋白,37℃条件下鉴定到25个差异蛋白,内含7个由pCD1质粒编码的蛋白。结论通过比较蛋白质组学研究,发现大质粒pCD1缺失后,多种染色体编码蛋白的丰度发生了显著变化,暗示大质粒能调控染色体编码基因的表达。     

小鼠吸入性鼠疫病理学和毒力相关基因的体内转录

目的探讨吸入感染鼠疫的发生、发展过程及重要鼠疫菌致病相关基因的体内表达规律。方法采用滴鼻法建立小鼠吸入性鼠疫感染模型，并观察不同感染时间的组织病理学改变；采用免疫组化和逆转录一实时定量PCR方法检测感染小鼠组织中鼠疫菌5种毒力相关蛋白及其基因（cafl、lcrV、lcrG、pla、psaA）的表达和转录。结果鼠疫菌吸入后可诱导小鼠产生肺鼠疫型和非肺鼠疫型鼠疫。在小鼠体内感染状态下的鼠疫菌体表面能够检测到上述5种毒力相关蛋白的表达。其毒力基因的转录呈时相、组织差异性。结论在体内感染状态下，5种毒力相关蛋白均呈菌体表面可检测到的表达；各毒力相关基因在不同时间、不同组织中转录具有很大的差异性，这种差异性可能与其功能及宿主细胞的作用密切相关。     

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型--田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变,所有甘油利用阴性菌株的glpD基因发生了突变,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型——田鼠型;相应糖醇代谢相关基因发生突变是4个生物型变异的遗传基础。     

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株pgm位点及其侧翼序列的变异,了解不同疫源地菌株间的毒力差异,为鼠疫防治提供帮助。方法比较分析现有4株菌的pgm位点及其侧翼序列的变异,采用PCR、等位基因特异性PCR扩增260株中国自然分离株和7株假结核耶尔森菌。结果除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外,其他菌株均缺失了YPl666的70～87bp之间的18bp碱基。1406bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点下游都没有IS100插入;锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有1个IS285插入,在其下游3kb区域还有1个IS100插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的pgm位点缺失,缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型,松辽平原B型,昆仑山A、B型4种生态型菌株中。结论北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支,建议归为第4个生物型——田鼠型。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点,由于在其下游没有IS100插入,所以稳定、不易缺失。pgm位点及其侧翼序列的变异与菌株的生物型、自然疫源地和生态型都具有一定的相关性。     

人ID4基因启动子及上游顺式表达调控元件的克隆及特征分析

目的克隆人ID4基因启动子及上游顺式调控元件,并对其结构及调控元件的特征进行生物信息学分析。方法从NCBI人类基因组数据库中截取ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列。利用TESS和Genomax等在线分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析。设计PCR引物,采用分段扩增法,获得长度分别为1811bp和650bp的两条产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆。先后应用KpnⅠ/NheⅠ、KpnⅠ/EcoRⅠ对获得的两个pGEM-T重组载体及pGL3Basic荧光素酶报告载体进行双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,最后测序鉴定。结果获得长度为2461bp的ID4基因启动子DNA序列,经测序证实与人类基因组序列一致。ID4基因具有Ⅱ型启动子特征,有2个非常显著的上游元件(TATA盒和GC盒),GC含量占总碱基含量的65.9%。在转录起始位点上游-1000bp与下游212bp之间分别存在多个可能具有正向和负向调控作用的顺式元件。结论成功克隆了人ID4基因启动子及其顺式调控元件,并...     

基于Luminex悬浮芯片的鼠疫耶尔森菌SNP分型方法研究

目的利用Luminex悬浮芯片技术,基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）建立我国鼠疫耶尔森菌东方型菌株（以下简称东方型鼠疫菌）的基因分型方法,为进一步研究东方型鼠疫菌多态性并分析其系统发育关系奠定基础。方法利用多重PCR,同时扩增东方型鼠疫菌中18个具有分型意义的SNP位点,扩增产物进行多重等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE）反应以及Luminex悬浮芯片技术分析,随后利用MasterPlex GT V2.3软件计算平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）比值,判断各SNP位点的碱基状态;并对SNP分型方法的重现性进行评价。结果 Luminex多重SNP技术能够快速、高通量地检测出各SNP位点的MFI值,从而在8 h内一次性成功确定东方型鼠疫菌中18个SNP的碱基状态;36株东方型鼠疫菌基于18个SNP可以分为7个基因型。结论本文建立的Luminex多重SNP检测方法作为一种高通量检测SNP的技术平台,为后期的东方型鼠疫菌SNP分型及系统发育分析奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

blaCTX-M-55介导的宋内志贺菌耐药机制研究

目的：研究 blaCTX-M-55介导的宋内志贺菌＃1083的耐药机制。方法双纸片协同扩散法验证＃1083是否为产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株;PCR 方法鉴定其耐药基因;接合转移实验验证携带 ESBL 基因的质粒是否具有可转移性;VITEK 2仪器检测菌株对多种抗生素的 MIC 值;基因组测序鉴定介导耐药基因转移的移动元件;引物延伸实验鉴定耐药基因转录起始位点。结果＃1083为 blaCTX-M-55介导产 ESBL 的菌株,携带 blaCTX-M-55的耐药质粒可通过接合转移的方式进入受体菌 EC600,并使受体菌具有相应的耐药谱;介导 blaCTX-M-55转移的转座单元为 ISEcp1-blaCTX-M-55-Δorf477,且其上游的插入序列 ISEcp1为耐药基因提供强启动子区,促进耐药基因表达,且此表达为恒定表达,不受抗生素的诱导作用影响。结论质粒携带的 blaCTX-M-55为＃1083的主要耐药基因,插入序列 ISEcp1介导此基因的表达与传播。     

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）Ⅲ型分泌系统（T3SS）相关蛋白β-内酰胺酶（TEM-1β-lactamases,Bla）报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内。方法将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫菌研究的TEM报告基因载体。把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达。将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2 h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能。本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础。     

鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗。方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6-mTn-3xHA／lacZ转座文库质粒中，将此重组质粒经Not Ⅰ酶切线性化，然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组，再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选。结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定，证明其为重组阳性转化子。结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统，用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原，为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件。     

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对36株鼠疫耶尔森菌和7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析,鉴定差异区段(DFR),并对260株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出22个DFR,基于DFR图谱,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有21个基因组岛,其中18个已存在于假结核杆菌中,余下3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统;建立了各基因组型别间的系统发育关系,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系,基本探明了鼠疫耶尔森菌在中国的演化规律。     

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的：研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异，为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法：通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果：与已测序的3株鼠疫菌基因组进行同源性比较，发现了259个假结核菌基因组中存在的特异序列，与基因库进行同源性比较发现了10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论：抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法，鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因，假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。