鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析

目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出4005条鼠疫耶尔森菌基因,PCR扩增各基因,以纯化的PCR产物点样制备芯片,采用双色荧光杂交策略,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。结论 成功建立了基于全基因组DNA芯片的鼠疫耶尔森菌比较基因组学技术平台。     

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对36株鼠疫耶尔森菌和7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析,鉴定差异区段(DFR),并对260株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出22个DFR,基于DFR图谱,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有21个基因组岛,其中18个已存在于假结核杆菌中,余下3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统;建立了各基因组型别间的系统发育关系,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系,基本探明了鼠疫耶尔森菌在中国的演化规律。     

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型--田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变,所有甘油利用阴性菌株的glpD基因发生了突变,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型——田鼠型;相应糖醇代谢相关基因发生突变是4个生物型变异的遗传基础。     

鼠疫耶尔森菌重组酶聚合酶核酸扩增荧光检测方法的建立

目的 建立一种简单,快速的重组酶聚合酶核酸扩增技术检测鼠疫耶尔森氏菌的方法.方法 基于耶尔森氏菌的特异性序列设计引物及探针;通过对不同温度的检测来优化反应温度;通过对不同菌株的DNA模板进行检测评价该方法的特异性;通过对不同稀释浓度的样本DNA模板进行检测来确定灵敏性;通过模拟样品进行应用评价.结果 基于鼠疫耶尔森菌的...     

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株91001为研究对象,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白,以3种不同方法(Shotgun-LC-MS-MS,1D-LC-MS-MS和2D-MS)进行分析,将分析数据与基于91001菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对,确定91001菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果Shotgun-LC-MS-MS方法鉴定了971种蛋白,1D-LC-MS-MS鉴定了915种,而2D-MS方法则鉴定了233种蛋白质,三者合计为1193种蛋白质,占基因组预测CDS的28．7％(1193／4143)。结论不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据,有必要同时采取多种方法进行分析。     

鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株91001的全基因组序列,并通过比较基因组学研究,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定91001菌株的全基因组序列,利用比较基因组方法对91001与另外2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 91001菌株的基因组包括1条染色体和4个质粒(pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为9609bp,与参考菌株基本一致;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒,长度为70159bp,编码情况与参考菌株基本相同,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异;pMT1质粒长度为106642bp,保留了较多的原始质粒片段,毒力相关基因与参考菌株没有差异;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒,在国内外研究中未曾报道,这一质粒长度为21742bp,具有独立复制能力,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。91001菌株的染色体长度为4595065bp,有4037个编码序列(CDS),其中141个是假基因;染色体中存在着非常丰富的插入序列,由于存在IS序列介导的基因组重排,91001菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析,初步确定了91001菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉伯糖分解代谢阴性以及蜜二糖分解阳性的遗传基础。结论 根据质粒结构、染色体基因组重排、硝酸盐还原阴性的机制以及假基因的分布等信息,推测以91001菌株为代表的田鼠型菌株是原始鼠疫耶尔森菌进化过程中的另一个分支,与现有菌株存在着比较明显的差异;而91001菌株独特的致病性可能与基因组中的假基因或大片段缺失有关。     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

奇异变形菌基因组文库的构建及标识序列的发现

目的:构建用于筛选奇异变形菌的特异序列的基因组文库,并从中筛选变形杆菌特异的标识序列.方法:提取奇异变形菌的基因组DNA,用Sau3AI部分酶切,回收酶切产物,然后与BamHⅠ酶切的pUC19质粒连接,转化JM109,构建奇异变形菌的基因组文库.随机挑取抗性克隆,用位于质粒上的引物进行扩增,确定插入片段的大小及分布情况.DNA测序确定部分克隆中插入的序列,根据序列设计引物,分析这些序列在奇异变形菌临床分离株中的分布,验证序列的特异性.结果:成功构建了奇异变形菌的基因组文库,库容量达到1.1×105 CFU.阳性克隆的比例为95%,插入片段大小主要分布在200~500 bp的范围.对其中14个克隆进行了序列测定,其中5个片段与已知序列有一定的同源性,另外9个与已知序列没有同源性,特异性分析发现了几个较好的标识序列.结论:成功构建了奇异变形菌的基因组文库,利用该文库发现了奇异变形菌特异的序列.     

PCR-SSP检测HLA-B27基因

目的 建立序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)检测HLA—B27基因的方法。方法 合成HLA—B27基因和内对照人生长激素基因引物各一对，建立PCR-SSP方法。提取82例患者临床样品基因组DNA，用于PCR扩增。其中20例与微量淋巴细胞毒法(MLCT)比较。结果 PCR检测HLA-B27阳性率为68．3％。20例样本同时行PCR-SSP和MLCT法，PCR阳性14例(70％)，MLCT法阳性11例(55％)，两者一致率为85％。结论 PCR—SSP是一种敏感特异、快速简便的HLA—B27检测方法，优于MLCT法。     

Smad3基因siRNA表达载体的构建及在瘢痕疙瘩成纤维细胞的沉默效应

目的构建针对Smad3基因的短片断干扰RNA(small interfer RNA,siRNA)表达载体,观察RNA干扰对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。方法根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,荧光定量PCR和Western-blot方法检测Smad3基因的表达情况。结果经测序鉴定DNA片段确已克隆入载体pLVshRNA-puro,测序结果提示三组碱基序列与靶序列完全相同。经荧光定量PCR和Western-blot方法检测示shRNA-smad3(CA3)沉默效率最高。结论证实实验构建的沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功,为下一步以TGF-β信号转导通路的Smad3因子为靶点的瘢痕疙瘩治疗实验研究奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的：研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异，为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法：通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果：与已测序的3株鼠疫菌基因组进行同源性比较，发现了259个假结核菌基因组中存在的特异序列，与基因库进行同源性比较发现了10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论：抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法，鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因，假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。     

A real-time fluorescence polymerase chain reaction assay for the identification of Yersinia pestis using a field-deployable thermocycler

Real-time fluorescence polymerase chain reaction is a microbial identification method that can provide rapid and accurate results using a field-deployable thermocycler, the RAPID ("ruggedized" advanced pathogen identification device). A Yersinia pestis-specific TaqMan assay required approximately 75 minutes and achieved a sensitivity of 100 fg of Y. pestis genomic DNA (20 genome equivalents). Specificity testing against a genomic DNA cross-reaction panel comprised of 22 bacterial species encountered in the respiratory tract resulted in no false positives. No cross-reaction occurred with human genomic DNA.     

鼠疫耶尔森菌活疫苗株的比较基因组学研究

目的揭示不同来源的鼠疫活疫苗株在基因组组成上的差异。方法以芯片比较基因组杂交为主要研究手段,结合PCR验证,对19株鼠疫活疫苗株进行比较基因组分析。结果鼠疫活疫苗株基因组中缺失了大量基因,但也有某些大片段基因的拷贝增多。结论不同来源的疫苗株在基因组组成上存在差异,构成了不同疫苗株的表型与使用效果具有差异性的遗传基础。     

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）Ⅲ型分泌系统（T3SS）相关蛋白β-内酰胺酶（TEM-1β-lactamases,Bla）报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内。方法将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫菌研究的TEM报告基因载体。把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达。将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2 h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能。本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值<15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值〈15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

基于Luminex悬浮芯片的鼠疫耶尔森菌SNP分型方法研究

目的利用Luminex悬浮芯片技术,基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）建立我国鼠疫耶尔森菌东方型菌株（以下简称东方型鼠疫菌）的基因分型方法,为进一步研究东方型鼠疫菌多态性并分析其系统发育关系奠定基础。方法利用多重PCR,同时扩增东方型鼠疫菌中18个具有分型意义的SNP位点,扩增产物进行多重等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE）反应以及Luminex悬浮芯片技术分析,随后利用MasterPlex GT V2.3软件计算平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）比值,判断各SNP位点的碱基状态;并对SNP分型方法的重现性进行评价。结果 Luminex多重SNP技术能够快速、高通量地检测出各SNP位点的MFI值,从而在8 h内一次性成功确定东方型鼠疫菌中18个SNP的碱基状态;36株东方型鼠疫菌基于18个SNP可以分为7个基因型。结论本文建立的Luminex多重SNP检测方法作为一种高通量检测SNP的技术平台,为后期的东方型鼠疫菌SNP分型及系统发育分析奠定了基础。