牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定

目的:为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型,并鉴定肝细胞的功能。方法:在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响。结果:分离得到的肝细胞成活率可达90%以上,纯度可达95%以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0/G1期,且基本无凋亡;SRB法和白蛋白分泌量检测结果显示,低糖DMEM组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1~5 d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P<0.05)。结论:体外培养的肝细胞活力和纯度均较高,体外培养后细胞功能正常,是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。     

比较两种消化酶对分离大鼠肝细胞的影响

目的:比较胶原酶和胰蛋白酶在分离大鼠肝细胞数量、活力、原代培养及MTT试验等四个方面的差别。方法:分别用胶原酶和胰酶分离获取大鼠肝细胞,通过台盼蓝拒染试验测细胞活力并计数,将分离的肝细胞进行原代培养并观察肝细胞形态变化,采用噻唑蓝(MTT)试验测肝细胞的增殖状况。结果:胶原酶分离的肝细胞数量是胰酶的2．4倍,而胰酶分离的肝细胞活力是胶原酶的2．8倍;胶原酶分离的肝细胞原代培养时贴壁慢,生长不良,而胰酶分离的肝细胞贴壁快,生长良好;MTT试验结果表明胰酶分离培养的细胞活性明显高于胶原酶。结论:胶原酶分离的细胞数量及纯度优于胰酶,而胰酶分离的细胞活力优于胶原酶。     

玉郎伞多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究玉郎伞多糖(YLS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用四氯化碳(CCl4)体外诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转换酶(AST)和丙氨酸氨基转换酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果:YLS(0.125~1.000g.L-1)可明显降低由CCl4升高的肝细胞培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞MDA含量,还可提高CCl4降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论:提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

用人和大鼠肝组织分离肝细胞的方法研究

1976年Seglen建立了“二步灌流法”分离大鼠肝细胞，大大地提高了肝细胞的产量和存活率，从而可以更好地利用原代培养的大鼠肝细胞作为体外模型探讨肝毒性作用及其机制。但是由大鼠肝细胞获得的结果外推于人有一定困难，若直接利用原代培养的人肝细胞作为体外模型，则可解决这一难题。已有学者分别     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用研究

目的利用原代培养正常大鼠肝细胞研究牛磺酸对肝细胞的毒性作用。方法用两步灌注法分离原代大鼠肝细胞;观察牛磺酸对原代大鼠肝细胞的毒性作用：MTT法测直接加牛磺酸的培养液和含牛磺酸大鼠血清的培养液对细胞生长抑制率的影响,计算IC50,并测定药物作用后培养液上清中AST、ALT和LDH活性及培养液中GSH和细胞内GSH的含量。结果MTT实验中细胞生长抑制率与剂量成正相关性,牛磺酸的IC50为24.23g/L。高浓度牛磺酸组培养液上清AST、ALT和LDH活性显著升高,培养液上清和细胞内GSH含量显著减少。结论高浓度的牛磺酸对体外培养的肝细胞有一定损伤。     

急性乙醇暴露对人原代培养肝细胞的氧化损伤

目的　研究急性乙醇暴露下人原代培养肝细胞的氧化损伤。方法　分离培养人原代肝细胞 ,以 2 5～ 10 0mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞 9h及 10 0mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞 0～ 2 4h后 ,分别检测人原代肝细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶 (aspartatetransaminase ,AST)、乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenate ,LDH)的释放量及肝细胞中谷胱甘肽(Glutathione ,GSH)、丙二醛 (Malondialdehyde ,MDA)和Fe2 的含量。结果　急性乙醇暴露导致人原代肝细胞上清液中AST、LDH的释放增加 ,并呈明显的剂量 效应和时间 效应关系 ;在 10 0mmol/L乙醇作用下 ,人原代肝细胞上清液中Fe2 和MDA含量明显升高 ,在 0～ 2 4h内呈明显的时间 效应关系 [Fe2 对照组 :( 60 5 0± 4 2 ) μmol/mgprot ,2 4h( 188 81± 9 6)μmol/mgprot;MDA对照组 :( 3 6 3 7± 3 64 )nmol/mgprot ,2 4h( 72 11± 3 2 6)nmol/mgprot] ,而GSH[对照组 :( 7 5 2± 0 2 9) ,2 4h( 0 5 0± 0 5 1)nmol/mgprot]含量在 0～ 1h内先升高 ,随后明显降低 ,差异有非常显著性。结论　 10 0mmol/L乙醇急性暴露下可导致人原代培养肝细胞的氧化损伤     

TGF-β对原代培养肝细胞及肝癌细胞BEL7401生长作用的影响

目的 研究转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）对正常大鼠肝细胞和肝肿瘤细胞的影响。方法 分离和培养原代大鼠肝细胞,培养ＢＥＬ４０１肝癌细胞,通过测定细胞ＤＮＡ合成、细胞活性（ＭＴＴ）及碱性磷酸酶活性,研究ＴＧＦ－β对正常大鼠肝细胞和肝肿瘤细胞的影响方式及可能的作用途径。结果 实验发现,ＴＧＦ－β可以刺激ＢＥＬ７４０１肝癌细胞的增生,促进其ＤＮＡ合成,并增强其活性ＳＴＧＦ－β对原代培养肝细胞ＤＮＡ合成无明显影响,对其活性有明显的抑制作用。实验还发现,ＴＧＦ－β明显刺激ＢＥＬ７４０１肝癌细胞中的碱性磷酸酶增高,同时抑制原代培养肝细胞的碱性磷酸酶活性。结论ＴＧＦ－β对正常细胞和肝癌细胞ＢＥＬ７４０１的生长有不同的影响作用,这种结果可能是通过不同的细胞信号传导途径实现的。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用

目的用原代培养正常大鼠肝细胞研究牛磺酸(β氨基酸)对肝细胞的毒性作用。方法用2步灌注法分离原代大鼠肝细胞;用MTT法测定细胞活力并计算IC50,观察药物作用后,培养液上清中AST、ALT和LDH活性及培养液中GSH和细胞内GSH的含量。结果细胞生长抑制率与剂量成正相关性,牛磺酸的IC50为24.23g.L-1。高浓度牛磺酸组培养液上清中AST、ALT和LDH活性显著升高,GSH含量显著减少。结论高浓度的牛磺酸对体外培养的肝细胞有一定损伤。     

肝细胞的体外培养及乙醛对肝细胞的形态影响

目的通过将肝实质细胞分离、纯化、体外培养,全面分析原代肝细胞的生长状态,研究乙醛诱发大鼠肝细胞毒性和胞内游离Ca2 变化及Ca2 螯合剂的干预效应,探讨乙醛致肝细胞损伤机制及Ca2 螯合剂的保护作用。方法分离培养大鼠原代肝细胞,以含300mmol/L乙醛的培养基培养肝细胞24、48h,相差倒置显微镜下观察肝细胞的形态变化。结果相差倒置显微镜下,新分离的大鼠肝细胞折光性强,有立体感,乙醛处理肝细胞24h后肝细胞体积肿胀,颜色变深,颗粒粗糙,部分细胞脱壁,少量细胞出现细胞壁缺失,呈放星状;乙醛处理48h后,可见到肝细胞质变稀疏,细胞核固缩,表面出现胞膜疱,细胞膜破碎;相当一部分细胞破碎脱落可见到一些核已消失的肝细胞浆或残屑。结论①乙醇可导致严重的肝细胞极性紊乱,导致细胞损伤,形成不同程度的病理状态,从而在细胞及分子水平对导致肝病形成的机理进行了探讨;②乙醛诱发肝细胞毒性和损伤可能与肝细胞[Ca2 ]i升高有关。     

齐墩果酸抗环磷酰胺所致大鼠肝细胞损伤作用

目的研究齐墩果酸（OA）对环磷酰胺所致大鼠肝细胞损伤的保护作用。方法分离大鼠肝细胞，进行原代培养。检测实验大鼠肝细胞上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肝细胞MTT值。结果环磷酰胺可使肝细胞上清液ALT、AST及LDH活力升高，肝细胞MTT值减小，齐墩果酸能抑制上述变化。结论齐墩果酸可抗环磷酰胺所致肝细胞损伤。     

改良后的大鼠原代肝细胞分离方法应用于格列喹酮肝摄取方式的考察

目的:对分离大鼠原代肝细胞的经典方法进行改良,使之更方便、高效、经济和实用;并将方法改良后分离获得的原代肝细胞进行贴壁培养用于格列喹酮的肝细胞摄取方式的考察。方法:将雄性Wistar大鼠于无菌条件下麻醉后固定,保持体温在37℃,对Seglen两步在体灌注分离原代肝细胞方法进行改进,采用先在体后离体的方法分离大鼠原代肝细胞,离心纯化后进行贴壁培养;将不同浓度格列喹酮溶液与贴壁的原代肝细胞共同孵育40 min, 1% Trion-X 100 裂解后,高效液相色谱-荧光法测定肝细胞裂解液中格列喹酮的浓度,BCA法测定细胞蛋白含量,绘制格列喹酮大鼠原代肝细胞摄取曲线,考察格列喹酮的肝细胞摄取方式。结果:经改良后,所分离的大鼠原代肝细胞数量有所提高,活性>80%,易于贴壁,形态良好,且节省试剂尤其是Ⅳ型胶原酶的用量;在15.625~720 μg·ml^-1范围内时,随着格列喹酮浓度的增大肝细胞对格列喹酮的摄取量呈近似线性的升高,并未呈现明显的饱和现象。结论:经典方法经改良后,分离获得的肝细胞活性高且易于贴壁,同时操作更为方便、高效,节约试剂尤其是昂贵的Ⅳ型胶原酶的用量,是较为经济、实用的方法;格列喹酮在15.625~720 μg·ml^-1范围内时,肝细胞对其摄取以自由扩散为主并非蛋白介导转运。     

大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

大鼠原代肝细胞药物相互作用模型的建立

目的 建立并考察适用于药物相互作用研究的体外大鼠原代肝细胞模型。方法 用改良Seglen两步灌流法分离肝细胞,以高糖DMEM为基础培养基培养细胞。通过检测细胞上清液中白蛋白(ALB)和尿素氮(BUN)水平、用底物探针法检测大鼠原代肝细胞中5种细胞色素P450(rCYP450)和葡萄糖醛酸转移酶(rUGT)代谢活性,考察培养时长对肝细胞功能和代谢酶活性水平的影响。原代肝细胞与利福平(RIF)、奥美拉唑(OMP)、β-萘黄酮(BNF)、苯巴比妥钠(PB)和地塞米松(DMS)共培养60 h,通过底物探针法检测代谢物的变化,用实时荧光聚合酶链反应法检测各组细胞代谢酶mRNA的表达水平,筛选多种代谢酶的阳性诱导剂。结果 改良后的分离方法可得到活率大于90%,能正常分泌ALB和BUN的原代肝细胞,培养至第9天仍可维持基本功能和正常形态。rCYP1A2、rCYP2B1和rCYP3A1随培养时长活性下降迅速,48和72 h下降至20.54%～23.15%和0～7.80%。rCYP2D2和rUGT酶活性下降较缓,48和72 h可维持在57.41%～76.77%和25.25%～35.24%。诱导剂筛选结果...     

藏药蕨麻对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究

目的 研究藏药蕨麻对原代培养酒精损伤肝细胞的保护作用。方法 原代肝细胞经分离纯化培养后,MTT法评价藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞存活率的影响;荧光染色法测定藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞活性氧物质(ROS)含量、细胞内钙离子浓度的影响;流式细胞仪检测藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞凋亡的影响;免疫印迹法检测藏药蕨麻对Bcl-2和Bax表达的影响。结果 经酒精损伤后,肝细胞存活率降低;细胞内ROS含量和钙离子浓度增高;凋亡抑制基因Bcl-2减弱、促凋亡基因Bax表达增强。藏药蕨麻可明显提高细胞存活率;降低细胞内ROS含量和钙离子浓度;改善凋亡情况,增强Bcl-2表达,抑制Bax表达,且作用呈剂量依赖性。结论 藏药蕨麻对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤具有一定的保护作用。     

硼替佐米对转基因小鼠原代肝细胞HBV的抑制作用

目的利用HBV转基因小鼠原代肝细胞评价蛋白酶体抑制剂硼替佐米的抗病毒效果。方法采用改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞;分别采用ELISA和荧光定量PCR法检测HBsAg和HBV-DNA的水平;采用MTT法观察不同浓度的硼替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞和HepG2.2.15细胞的毒性,观察其作用24 h后细胞培养上清中病毒学指标的变化。结果分离的原代肝细胞纯化后活细胞占0.90,HBsAg和HBV-DNA在5 d内均能稳定表达。药物作用24 h后,MTT结果显示260μmol·L-1及以下浓度的硼替佐米对原代肝细胞无明显毒性,但对HepG2.2.15细胞显示较强的细胞毒性,其最大无毒浓度为12.5 nmol·L-1。药物在0.026μmol·L-1～26μmol·L-1的浓度范围内对转基因小鼠原代肝细胞HBsAg和HBV-DNA有明显抑制作用。结论硼替佐米在体外对HBV有抑制作用;HBV转基因小鼠原代肝细胞可用于抗肿瘤药物的抗HBV活性研究。     

重组人肝细胞生长因子β链体外生物学活性的测定

目的　建立一种稳定灵敏的方法用于检测重组人肝细胞生长因子β链 (rhHGF β)对原代培养成年大鼠肝细胞的增生作用。方法　利用噻唑蓝 (MTT)比色方法在多种实验条件下对rhHGF β进行生物学活性检测。结果　对于体外原代培养成年大鼠肝细胞 ,rhHGF β可刺激肝细胞的增生 ,且有剂量依赖效应。 结论　确定了原代培养肝细胞检测rhHGF β生物活性的最佳条件方案     

大鼠原代培养肝细胞作为早期肝毒性筛选模型的研究

目的研究大鼠原代培养肝细胞作为早期肝毒性的筛选模型的生物学特征。方法采用二步灌流法分离提取大鼠肝细胞进行培养;采用荧光倒置显微镜观察原代培养肝细胞的生长情况;采用MTT法绘制肝细胞生长曲线;采用全自动生化分析仪检测细胞上清液的ALT、AST、ALP、CK、LDH、TP、ALB、GGT值;采用爬片技术进行HE检查;采用Elisa法检测细胞上清液中细胞色素P450(CYP450)的总量,并采用肝细胞毒性药物对乙酰氨基酚对肝细胞作为早期肝毒性筛选模型进行验证。结果肝细胞培养4 h后开始贴壁,24 h后绝大多数肝细胞贴壁,体积明显增大;48 h后肝细胞贴壁牢固,维持至第8日,细胞开始逐渐脱落。肝细胞的对数生长期为第2至第3日,ALT、AST、LDH、CK在提取4 h后增高,第1日大幅降低后趋于平稳至第7日。TP、ALB、GGT、ALP提取4 h降低,后趋于平稳至第7日,肝细胞CYP450第1日至第5日分泌呈上升趋势,第6⁷日,轻微下降。HE结果显示提取的肝细胞与肝组织的HE涂片基本一致。对乙酰氨基酚对肝细胞的生长具有抑制作用,IC50为20.5 mmol·L-1,能使肝细胞肿胀,细胞核萎缩,使肝细胞分泌ALT、ALP、LDH增多,对肝细胞分泌CYP450的功能具有抑制作用。结论系统全面的阐述肝细胞的生物学特征及在早期毒性评价中的应用,肝细胞作为肝早期毒性筛选模型敏感的评价指标,对于原代培养肝细胞用于药物的早期毒性筛选研究起到了一个示范作用。     

诱导血红素氧化酶表达对乙醇所致人原代肝细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨乙醇暴露与诱导血红素氧化酶(HO 1)表达之间的关系。方法　经体外灌流、分离培养人原代肝细胞 ,观察 10 0mmol·L- 1乙醇暴露 9h后谷胱甘肽 (GSH) ,谷草转氨酶 (GOT) ,乳酸脱氢酶 (LDH)和丙二醛 (MDA)的变化以反应人原代肝细胞的氧化损伤 ,用RT PCR及Western印迹方法检测乙醇对人原代肝细胞HO 1mRNA及蛋白表达的影响。结果 10 0mmol·L- 1乙醇暴露 9h后可导致人原代肝细胞明显的氧化损伤 ,肝细胞中的GSH明显降低 ,而MDA明显升高 ,GOT和LDH ,此外 ,急性乙醇暴露下 ,HO 1表达开始应激升高 ,随后慢慢降低 ,肝细胞经HO 1诱导剂预处理后再与乙醇作用 ,能减轻乙醇对肝细胞的氧化损伤作用 ,并且这种作用可被HO 1抑制剂所抵消。结论　诱导HO 1对乙醇所致人原代肝细胞的氧化损伤有保护作用。