pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达

目的 构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,为进一步研究DJ-1M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定.结果 pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1 M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I重组表达质载体.     

转染DJ-1和DJ-1L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的 在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究,为进一步建立DJ-1和DJ-1L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础.方法 采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段,采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变,分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pEGFPDJ-1、DEGFP-DJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测.结果 pEGFP-DJ-1、pEGFPDJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后,分别获得6、2、9个阳性细胞克隆,RTPCR及westem blot 方法进行tau基因表述检测,结果均显示pEGFP-DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP-C3质粒转染组,而pEGFP-DJ-1L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP-C3质粒转染组,实验结果统计学分析均具有明显差异(P＜0.05).结论 在转录水平及蛋白质水平,DJ-1基因使tau基因的表达下降,而DJ-1L166P使tau基因表达上升.在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性.     

转染DJ-J和DJ-1^L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1^L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究，为进一步建立DJ-1和DJ-1^L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础。方法采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段，采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变，分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1^L166P重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pEGFP-DJ-1、pEGFP-DJ-1^L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测。结果pEGFP—DJ-1、pEGFP-DJ-1^L166P、pEGFP—C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后，分别获得6、2、9个阳性细胞克隆，RT—PCR及western blot方法进行tau基因表达检测，结果均显示pEGFP—DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP—C3质粒转染组，而pEGFP—DJ-1^L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP—C3质粒转染组，实验结果统计学分析均具有明显差异（P〈0．05）。结论在转录水平及蛋白质水平，DJ-1基因使tau基因的表达下降，而DJ-1^L166P使tau基因表达上升。在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

转染节律基因mPeriod2对小鼠正常细胞放射损伤的影响

目的评价mPeriod2（mPer2）基因转染后过表达对小鼠肺成纤维细胞NIH3T3放射损伤的影响。方法采用脂质体介导法将roPer2基因转染人NIH3T3细胞中，以空质粒pcDNA3.1和空白组为对照，采用流式细胞术检测mPer2基因在NIH3T3细胞中的表达，经过^60Co—γ射线放射处理后，用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布，采用平板克隆形成试验检测细胞增殖情况。结果射线照射后，与pcDNA3．1空质粒组和空白对照组相比，pcDNA3．1-mPer2转染组凋亡率下降，S期细胞所占比例增高，克隆形成率明显增高。结论节律基因mPer2过表达会使γ射线照射后的NIH3T3细胞凋亡下降，增殖加快，减弱了细胞的放射损伤。     

人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的：扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础。方法：利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达。结果：从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41％的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达。结论：利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达。     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

节律蛋白mPER1在NIH3T3细胞增殖和迁移中的作用

目的 研究PER1蛋白对NIH3T3细胞增殖和迁移的影响.方法 将重组表达质粒pcDNA3.1/mPER1转染入NIH3T3细胞中,并以未转染的NIH3T3细胞为对照,利用MTT法检测细胞增殖的改变.利用RT-PCR技术和Western blot检测节律蛋白mPER1对细胞迁移关键性蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.结果 MITT法显示PER1表达上调可以抑制NIH3T3细胞增殖,RT-PCR技术和Western blot检测显示在NIH3T3细胞中,当节律蛋白mPER1表达上调时,细胞迁移关键性蛋白MMP-2在RNA和蛋白水平的表达较对照组降低.结论 上调NIH3T3细胞内的PER1蛋白表达能抑制细胞增殖以及细胞迁移的关键性MMP-2在RNA和蛋白水平的表达.     

大肠癌细胞线粒体DNA与NIH3T3细胞核基因组整合的荧光原位杂交分析

目的:观察大肠癌细胞突变的线粒体DNA(mtDNA)转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,mtDNA与转染细胞核内基因组的整合情况.方法:将携带大肠癌细胞突变mtDNA的重组质粒pcDNA3.1( )-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1( )-NHWBC mtDNA及空质粒pcDNA3.1( )通过脂质体法转染NIH3T3细胞.同时用PCR法制备3条相应的绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针.分离转染的NIH3T3细胞核内染色体,用荧光原位杂交(FISH)法检测mtDNA探针与核内基因组的整合情况.结果与结论:瞬时转染的NIH3T3细胞核基因组上存在mtDNA的同源序列.外源肿瘤细胞mtDNA与NIH3T3细胞核内基因组发生整合.     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

稳定表达Trop-2基因的NIH3T3细胞系的构建和特性分析

目的:建立稳定表达人滋养层细胞表面抗原(Trop-2)NIH3T3细胞,分析过表达Trop-2对NIH3T3细胞的生长?增殖和侵袭特性的影响?方法:将Trop-2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,转染NIH3T3细胞,通过G418筛选及RT-PCR鉴定获得稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞(NIH3T3-Trop-2)?用MTS法检测NIH3T3-Trop-2细胞的增殖能力,软琼脂集落形成实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的克隆形成能力,明胶酶谱法检测NIH3T3-Trop-2细胞的基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌及细胞划痕实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的迁移能力?结果:稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞在生长增殖?克隆形成及侵袭能力均较NIH3T3细胞强,细胞培养上清中的MMP-2和MMP-9增多?结论:Trop-2对细胞的增殖与迁移能力具有明显的促进作用?     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

LncRNA-MEG3 对胃癌生物学特性 及铂类化疗敏感性的研究

目的 探讨LncRNA-MEG3 对胃癌增殖、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法 以人正 常胃黏膜上皮细胞GES1 作为对照细胞,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测胃癌MKN28、 SGC7901、AGS 及BGC823 细胞中LncRNA-MEG3 的表达;将过表达MEG3 的质粒转染BGC823 细胞作为 pcDNA3.1-MEG3 组,转染空白质粒的阴性对照作为pcDNA3.1 组,同时设置Control 组;将BGC823 细胞 分为pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-MEG3 组、顺铂组及pcDNA3.1-MEG3+ 顺铂组。qRT-PCR 检测转染48 h 后细胞中LncRNA-MEG3 的表达;pcDNA3.1-MEG3、顺铂单独或共同处理BGC823 细胞,细胞计数试剂 盒法及流式细胞仪分别检测细胞活力及凋亡率;Western blotting 检测STAT3、磷酸化的信号转导与转录因 子3（p-STAT3）、Cyclin D1 和Bcl-2 的表达。结果 胃癌细胞中LncRNA-MEG3 的表达均低于GES1 细胞 （P <0.05）;4 组LncRNA-MEG3 相对表达量比较,差异有统计学意义（P <0.05）;pcDNA3.1-MEG3 组和顺 铂组Cyclin D1、Bcl-2 及p-STAT3 的蛋白表达低于pcDNA3.1 组（P <0.05）,细胞凋亡率高于pcDNA3.1 组 （P <0.05）。结论 胃癌细胞中LncRNA-MEG3 表达降低,过表达LncRNA-MEG3 可降低胃癌细胞活力并诱 导细胞凋亡,增加顺铂的化疗敏感性,其机制与下调STAT3 信号通路有关。     

The effect of MAGE-A1 gene on NIH3T3 cells

Objective: Melanoma antigen genes(MAGE) genes have been found in many kinds of tumor tissue, but not in normal tissue except testis and placentas. The Ags encoded by MAGE genes therefore are strictly tumor-specific. The most current researches associated with these genes focus on the tumor vaccination using these Ags. Few reports are concerning these genes‘ functions. In this study, we investigated the role of MAGE-A1 gene on NIH3T3 cells after transferring with it. Methods: Clone the MAGE-A1 into the plasmids pEGFP-C3 and pcDNA3.1, then transfer the reconstructed plasmids and primary plasmids into the NIH3T3 cells using a new transfer reagent FuGENE 6. Selecting the positively transferred cells by G418. Identified by RT-PCR, Western blot, Immunocytochemistry,Laser Scanning Confocal Microscope and Fluoroscope. The cells mobile ability was measured with Millicell-PCF. The cell cycle and apoptosis were measured with Flow Cytometry. Results: The apoptosis rate of NIH3T3 cells that transferred with control plasmid pcDNA3.1 was 13.4% and the ratios that stay in S phase and G2-M phase were 5.68% and 1.04,% respectively. The apoptosis rate of NIH3T3 cells that transferred with pcDNA3, l-A1 was 0.90% and the ratios that stayed in S phase and G2-M phase were 19.31% and 13.47% respectively. The apoptosisrate of the cells that transferred with control plasmid pEGFP-C3 was 1.87%, a little higher than 1.47% of those transferred with pEGFP-C3-A1. Conclusion:The MAGE-A1 gene may enhance the cell cycle, inhibit the apoptosis and raise the mobile ability of NIH3T3 cells.