自由基损伤和β2糖蛋白1在自身免疫疾病中的作用

目的 研究被自由基氧化修饰的β2糖蛋白1(β2GPl)在自身免疫疾病中自身抗体产生中的作用。方法 采用高氯酸沉淀，两步肝素连接的交联琼脂糖凝胶层析结合葡聚糖凝胶G—100分离纯化大鼠β2GP1；应用自由基氧化修饰大鼠β2GP1；氧化修饰的β2GP1(oxβ2GPl)、β2GPl分别加与不加心磷脂(CL)及CL免疫大鼠，ELISA方法检测免疫大鼠血清中抗β2GP1抗体和抗心磷脂抗体(ACA)。结果 两步亲和层析结合凝胶过滤层析有效地分离纯化了大鼠β2GPl，蛋白纯度达90．78％；通过碳基含量测定证实了自由基对β2GP1的氧化修饰；oxβ2GGP1加CL、β2GP1加CL、oxβ2GPl免疫组与空白对照组、实验对照组比较ACA水平有显著升高(P＜0.001)，oxβ2GP1加CL免疫组与β2GPl加CL免疫组比较ACA水平差异有显著性(P＜0.05)；oxβ2GP1免疫组与oxβ2GPl加CL免疫组比较ACA水平差异不显著(P＞0.05)；oxβ2GPl加CL、oxβ2GPl免疫组与对照组比较，抗oxβ2GP1抗体水平有显著升高(P＜0.05)。结论 两步肝素连接的交联琼脂糖凝胶层析结合葡聚糖凝胶G—100能有效地分离纯化β2GPl；oxβ2GPl诱导了ACA和抗oxβ2GPl抗体的产生；β2GPl可能是自身免疫疾病发生过程重要的辅助因子或靶抗原，而自由基对β2GP1损伤可能是自身免疫疾病发病机制中的一个重要病理过程。     

IL—4对小鼠腹腔巨噬细胞抗弓形虫作用的影响

目的：观察体外IL-4和IFN-γ对^3H—尿嘧啶(^3H—U)标记的弓形虫(Toxoplasma gondii,TG)在小鼠腹腔巨噬细胞(Mouse peritoneal macrophage MPM)内增殖的影响。方法：应用^3H—U标记的TG在MPM内的增殖实验及^125I—UdR标记的细胞毒实验。结果：单独应用IL-4预先处理MPM，可部分抑制TG在MPM内的增殖，增加IL-4剂量抑制作用末见明显增加；IL-4可增加IFN-γ诱导的MPM抗TG效应，但无协同作用。结论：表明IL-4对小鼠MPM抗TG作用与IFN—γ不同；抗TNF—α中和抗体对IL-4诱导的TG在细胞内增殖抑制作用无明显影响。     

流式细胞术检测细胞毒方法的建立

目的：建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法。方法：用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞，再用碘化丙碇(PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞。效靶比为100：1—6．25：1，共孵育时间为1-6小时，流式细胞仪收集1000个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。结果：CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料，18小时后也能很好地区分效靶细胞；靶细胞的自然死亡率低于5％；杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为50：1—25：1，共孵育时间为2—4小时。结论：CFSE／PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点：避免放射性试剂的应用，敏感性增强，单细胞水平的分析。     

人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的：利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子，并利用镍金属螯合层析法进行纯化，探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法：采用RT-PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA，将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，并利用镍金属螯合层析法进行纯化。^3H-TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：利用pQE30表达载体表达的含6个组氨酸尾的vasostafin蛋白，在SDS-PAGE上表现出一条约2lkD的阳性条带，经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白，在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论：人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达，并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性．     

应用微囊化转基因细胞进行小鼠腹腔移植的实验研究

目的:探讨微囊化转基因细胞用于异体细胞移植治疗的可能性。方法:使用静电液滴技术制备海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,包埋转入癌胚抗原部分基因的人成纤维样骨髓基质细胞,进行实验小鼠腹腔移植。结果:微囊化人源细胞移植到小鼠腹腔3个月内,细胞可以继续生长、增殖并提高小鼠的兔疫功能。结论:海藻酸钠-壳聚糖作为成囊材料具有良好的生物相容性、囊膜强度和免疫隔离作用;微囊化细胞移植有助于扩大异体移植的细胞来源,并为构建微囊化转基因细胞疫苗治疗恶性肿瘤的研究提供了可靠的依据。     

人白细胞介素18(hIL-18)的纯化及生物学活性的鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达重组人IL-18(rhIL-18)蛋白，制备具有高纯度、高活性的rhIL-18。方法：用IFTG诱导重组蛋白表达载体pKK223-3／hIL-18进行蛋白表达；菌体经超声破碎分离包含体，并对包含体进行洗涤、变性和复性处理，用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱纯化复性的rhIL-18；以人外周血单核淋巴细胞，通过T细胞增殖实验、^125I-UdR标记的细胞毒实验、ELISA方法检测细胞因子的产生量等方法，测定rhIL-18的生物学活性。结果：在大肠杆菌中成功地诱导、表达了rhIL-18，SDS-PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约18．3kD处有一诱导蛋白带，Western blot证明表达产物与抗IL-18单克隆抗体有特异性免疫反应；表达产物经纯化后纯度达94％；表达的rhIL-18蛋白具有促进T细胞增殖、增强NK细胞细胞毒作用及诱导外周血单核淋巴细胞合成IFN-γ的能力，基本上具有天然IL-18相同的生物学活性。结论：为rhIL-18的获得及为进一步研究其生物学功能提供了一定的条件，并为将rhIL-18用于肿瘤的免疫生物治疗奠定了基础。     

IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤特异性CTL杀伤效应的影响

目的应用rhIL-18在体外培养系统(Coculture system in vitro,CCs)中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL),探讨IFN-γ在rhIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程及杀伤效应中的作用.方法采用Stem SepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及DCs细胞,流式细胞仪分析细胞表型,125Ⅰ-UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性,ELISA方法检测IFN-γ蛋白产生量,RT-PCR检测IFN-γ mRNA表达含量.结果在肿瘤抗原存在的条件下,IL-18在CCs中能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应;IL-18能够在肿瘤抗原刺激的CCs中诱导IFN-γ mRNA的表达及IFN-γ蛋白的产生,并与IL-18的含量呈剂量依赖关系,在rhIL-18含量为100 ng时,培养上清中IFN-γ为4 410±210 pg/ml.但加入抗IFN-γ抗体对rhIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程无明显影响,不能抑制IL-18诱导的这种肿瘤特异性CTL的杀伤效应.结论IL-18能够在肿瘤抗原刺激的CCs中有效地诱导CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应,并诱导IFN-γ的产生,但其诱导肿瘤特异性CTL的产生过程及杀伤效应与IFN-γ无关.     

重组人β2糖蛋白1第一结构域对抗磷脂抗体综合征患者血清诱导人脐静脉内皮细胞产生ICAM-1、MCP-1的影响

目的：探讨重组人β2糖蛋白1第一结构域（hrβ2GPⅠDⅠ）对抗磷脂抗体综合征（APS）患者血清诱导人脐静脉内皮细胞产生细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响。方法：应用hrβ2GPⅠDⅠ二聚体处理前后的APS患者血清分别与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共孵育，细胞EL／SA和RT-PCR方法分析处理前后HUVEC表达ICAM-1、MCP-1的变化。结果：hrβ2GPⅠDⅠ二聚体处理后的APS患者血清较处理前相比，与其孵育的HUVEC表达ICAM-1、MCP-1在蛋白和mRNA水平均明显降低。结论：邮：GPⅠDⅠ可中和APS患者血清中的大部分致病性抗β2GPⅠ抗体（anti-β2 GPⅠ）。     

门奇断流术手术前、后血液动力学变化

为进一步研究门奇静脉断流手术前、后血液动力学的变化,我们采用吲哚氰绿负荷试验ＫＩＣＧ的方法,对门奇静脉断流手术的患者,分别进行了手术前、后ＫＩＣＧ、ＨＢＦ的测定,并对相互间的关系进行了探讨。结果表明：门奇静脉断流手术前、后Ｋ１ＣＧ无显著差异（Ｐ＞０．０５）;门奇静脉断流手术前、后ＨＢＦ无明显的变化。Ｋ１ＣＧ与ＨＢＦ呈正相关系。说明门奇静脉断流手术对肝机能和肝血流量的影响不大     

IL-6对弓形虫增殖的影响

目的：观察白细胞介素－６（ＩＬ－６）对弓形虫增殖的影响。方法：以Ｃ５７ＢＬ／６小鼠腹腔巨噬细胞为靶细胞,采用３Ｈ－尿嘧啶（３Ｈ－Ｕ）特异性标记的弓形虫在ＭΦ内的增殖实验。结果：单独应用ＩＬ－６处理ＭΦ,可以促进弓形虫在ＭΦ内的增殖,α肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）的影响不明显;而在ＩＬ－６逆转γ干扰素（ＩＦＮγ）诱导的ＭΦ抗弓形虫效应的实验中发现,加入抗ＴＮＦα抗体可增加ＩＬ－６对ＩＦＮγ诱导ＭΦ抗弓形虫效应的逆转作用。结论：体外应用ＩＬ－６可促进弓形虫在小鼠腹腔ＭΦ内的增殖作用,并能部分逆转ＩＦＮγ的抗弓形虫效应。