CDK2干扰RNA对人肝癌细胞HepG_2细胞周期和增殖的影响

目的:探讨CDK2 siRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞CDK2 mRNA表达及其对HepG2细胞周期和增殖的影响.方法:利用脂质体转染法将特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒PGenesil-1-CDK2导入HepG2细胞,同时设立阴性对照空载体转染组PGenesil-1-HK.G418筛选稳定表达细胞株扩增培养.并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术(FCM),分别检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA和细胞周期的变化,噻唑蓝(MTT)法检测癌细胞生长增殖率.结果:经1mo的G418筛选得到稳定表达细胞株,与阴性对照组及空白对照组相比,转染组CDK2 mRNA 水平明显下降,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生阻滞.结论:RNA干扰技术可明显抑制CDK2基因的表达,引起 HepG2细胞周期阻滞及肿瘤细胞生长抑制作用,为CDK2介导的肿瘤基因沉默疗法提供实验依据.     

靶向CDK2、cyclinE的siRNA对HepG2细胞周期及凋亡的影响

目的：探讨细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent-kinase 2,CDK2）活性对肝癌细胞株HepG2细胞周期和细胞凋亡的影响。方法：根据基因库中登录的人和鼠CDK2、cyclinE序列,设计并构建CDK2、cyclinE干扰RNA真核表达载体;脂质体法转染肝癌细胞株HepG2细胞,流式细胞术分析CDK2及cyclinE对HepG2细胞增殖的影响;蛋白质印迹法检测CDK2、cyclinE活性的变化caspase-3活性的影响。结果：1.成功构建CDK2及cyclinE干扰RNA真核表达载体psiCDK2、psiCyclinE,用脂质体法导入肝癌细胞株HepG2细胞中,有效表达。2.转染48h后与空载体组相比：psiCDK2、psiCyclinE组G1期细胞增多,G2/M和S期细胞减少;蛋白质印迹法分析表明psiCDK2、psiCyclinE组caspase-3酶原被激活。结论：靶向CDK2、cyclinE的siRNA能抑制HepG2细胞的增殖;靶向CDK2、cyclinE的siRNA能激活caspase-3,诱导肝癌细胞HepG2凋亡。     

miR-107对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨miR-107对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响,以及对CDK6蛋白表达的调控。方法将50 nmol/L的miR-107 mimics 或阴性对照序列由 Lipofectamine 2000转染入人肝癌细胞株 HepG2中;qRT-PCR 法检测转染后HepG2细胞内miR-107表达水平;四甲基偶氮唑蓝( MTT)法检测细胞增殖能力;流式细胞术分析转染后细胞周期的变化;Western blot法检测CDK6蛋白表达水平。结果转染后24 h,miR-107 mimics转染组细胞内miR-107表达水平较空白对照组明显升高(P<0.05);与空白对照组相比,miR-107 mimics转染组HepG2细胞增殖受抑制( P<0.05),处于G0/G1期的细胞增多( P <0.05), CDK6蛋白表达下调( P <0.05)。结论 miR-107能够抑制 HepG2细胞增殖并诱导HepG2细胞G0/G1期阻滞,这可能与其抑制 CDK6蛋白的表达有关。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

Apaf-1通过wnt/β-catenin信号通路调控肝癌的机制研究

目的 研究Apaf-1基因在wnt/β-catenin信号通路中的作用及在肝癌细胞中的调控表达机制.方法 通过TOP-flash实验验证Apaf-1基因在wnt/β-catenin信号通路中调控作用机制;采用实时定量PCR方法检测各种肝癌细胞株(HepG2、H HCC、HB611)及正常肝细胞株(LO2)中Apaf-1基因的表达量;构建Apaf-1 RNA干扰质粒,转染到HepG2中并检测转染效率,检测相关基因及蛋白表达.结果 TOPflash实验发现Apaf-1可以抑制wnt/β-catenin信号通路,并且这种抑制作用具有剂量依赖效应;在肝癌细胞株中,Apaf-1表达量较正常肝细胞表达量降低,且在HepG2细胞株中表达量最低;在肝癌细胞株(HepG2)中RNA干扰Apaf-1基因,Apaf-1基因的的表达量显著降低,wnt信号通路下游基因及蛋白(β-catenin、Cyclin A、CDK2、wnt5a、STAT3、EGFR、APC)的表达量均显著性升高或降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Apaf-1基因通过wnt/β-catenin信号通路在肝癌细胞的生成过程中具有重要功能.     

脂质体介导Cyclin D1干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2全细胞蛋白质组表达的影响

目的探讨CyclinD1干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2细胞中CyclinD1mRNA的表达、对细胞周期和增殖以及蛋白质组表达变化的影响。方法构建CyclinD1干扰RNA的重组质粒pU6-CyclinD1-siRNA,并设立阴性对照空载体转染组和空白对照组。采用脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞,经G418筛选阳性转染细胞克隆,流式细胞术、MTT法检测其细胞周期、细胞生长曲线的改变;反转录PCR法及双向凝胶电泳．质谱技术比较转染前后CyclinD1mRNA的表达和蛋白质组表达的变化。结果（1）成功构建了CyclinD1干扰RNA的重组质粒pU6．CyclinD1．siRNA。并获得稳定转染组细胞HepG2-CyclinD1siRNA。（2）稳定转染组细胞与阴性对照组细胞和空白对照组相比,CyclinD1mRNA表达水平降低。细胞周期明显改变,从G1期到s期发生阻滞。（3）通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白6个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、角蛋白19、热休克蛋白伴侣素10、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白。这些蛋白与细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、以及肿瘤的发生、发展等相关。结论CyclinD1干扰RNA可明显降低肝癌HepG2细胞CyclinD1mRNA的表达,亦可阻滞肝癌HepG2的细胞周期,抑制细胞增殖;CyclinDI干扰RNA干扰后差异表达的蛋白质涉及细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、以及肿瘤的发生、发展。     

沉默GPC-3基因质粒构建及对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白多糖(glypican,GPC)-3 shRNA质粒,观察GPC-3活化干扰对肝癌(HepG2)细胞的抑制作用。方法:设计与合成多条针对GPC-3序列的shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建、转染HepG2细胞、筛选高效质粒,观察沉默GPC-3表达对肝癌细胞增殖的抑制作用与机制。结果:经BamHⅠ或PstⅠ酶切鉴定,证实插入pGPU6/GFP/Neo载体GPC-3 shRNA序列正确,成功构建GPC-3 shRNA干扰质粒。以脂质体介导,将GPC-3shRNA1～4分别转染HepG2细胞,shRNA1沉默GPC-3 mRNA最高效率达89.3%,可有效抑制HepG2细胞增殖,在72 h达71.1%;shRNA1干扰使HepG2细胞周期阻滞在G1期,促进癌细胞发生凋亡(65.6%)。结论:shRNA可有效干预肝癌细胞GPC-3基因转录,促进凋亡并抑制增殖,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制研究

目的:研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响,并对其影响肝癌细胞增殖的机制进行探讨,为STAT5A基因在肝细胞癌中的功能研究提供实验依据。方法:构建针对STAT5A基因的shRNA真核表达载体,脂质体法转染人肝癌细胞HepG2,采用半定量RT-PCR的方法检测细胞中STAT5A mRNA的变化;蛋白质印迹技术检测转染前后细胞中STAT5A蛋白、细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白表达的变化;采用MTT法检测细胞增殖的情况。结果:酶切及测序结果显示shRNA表达载体均构建成功,转染HepG2细胞48h后,与对照组相比,RT-PCR结果显示实验组细胞中STAT5A mRNA的抑制率为72.03%(P<0.05),蛋白质印迹法显示STAT5A蛋白的抑制率为66.27%(P<0.05),细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白表达下降47.16%(P<0.05),同时MTT法显示细胞生长速度减慢、增殖抑制明显。结论:抑制STAT5A基因的表达可有效抑制HepG2细胞的增殖,其机制可能是通过下调Cyclin D1的表达实现的。     

人VIGILIN的shRNA真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞周期影响的初探

目的构建靶向人高密度脂蛋白结合蛋白(VIGILIN)的shRNA真核表达载体,并初步探索VIGILIN与人肝癌细胞系HepG2细胞周期是否有关联。方法构建人VIGILIN的shRNA重组质粒,并将重组质粒pSIREN-VIG转染HepG2细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测HepG2细胞VIGILIN mRNA和蛋白的表达,并用流式细胞术检测细胞周期是否有所改变。结果1HepG2细胞转染pSIREN-VIG后,VIGILIN的表达被特异、有效地抑制。转染48h后,VIGILIN的表达从mRNA和蛋白的水平都有明显的减少;2VIGILIN表达抑制后,G2/M期细胞所占比例增加:相对于三个对照组(未转染组2.4%,脂质体转染组4.9%和转染pSIREN-GFP组6.5%),实验组(转染pSIREN-VIG组)G2/M期细胞增加到9.4%。结论我们成功的构建了能特异、有效的抑制人VIGILIN表达的shRNA表达质粒,人VIGILIN能够影响到细胞周期的正常运行,导致G2/M期阻滞。     

CyclinE干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和蛋白质组的影响

目的:研究siRNA对HepG2细胞株cyclinE表达的抑制及细胞生长的影响,并用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质.方法:构建质粒表达载体pU6-cyclinE-shRNA,稳定转染肝癌HepG2细胞株,获得HepG2-cyclinEshRNA细胞系,RT-PCR检测cyclinE mRNA表达,MTT测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期.裂解、抽提HepG2-cyclinEshRNA细胞和Cl期肝癌HepG2细胞全蛋白,用双向电泳技术进行分离后.用Proxpress2D分析软件对两组细胞全蛋白质表达谱进行差异分析,并应用MALDI-TOF-MS和数据库搜索鉴定差异显著的蛋白点.结果:HepG2-cyclinE-shRNA细胞与转染空质粒HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,生长速度减慢,出现G0/G1期细胞增多,C2/M和S期细胞减少.双向电泳后软件分析G1期肝癌HepG2细胞株平均检测到435±51(n=3)个蛋白点,HepG2-cyclinEshRNA细胞376±44(n=3)个,匹配分析,筛选出两组间差异6倍及以上且出现频率大于等于50%的蛋白点20个.应用质谱鉴定出角蛋白19、波形蛋白、神经多肽113等8个G1期HepG2细胞高表达蛋白点.结论:在HepG2细胞株中,导入eydinE干扰RNA,可有效抑制cyclinE的表达,进而使细胞增殖减缓,逆转其恶性表型.两组细胞蛋白质谱有明显差异,鉴定出G1期HepG2细胞高表达蛋白点8个,这些蛋白的高表达引起肿瘤的基因修饰异常、分化异常、增殖紊乱,肿瘤侵袭转移.     

人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控.方法 通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达.结果 ① HepG2细胞周期约为20 h;其中0～9 h、20～28 h约为S期,9～20 h、28～39 h约为G2/M、G1期,并选定6 h、20 h、43 h、60 h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末; ②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰.而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性.H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05).③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48 h后,相对于3个对照组(未转染组, 脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组), 实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2 mRNA表达增加30.13%,H19 mRNA表达减少12.08%.结论 VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达.     

奥沙利铂对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响

目的:探讨奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)对人肝癌细胞株HepG2周期的影响及其相关机制,为其应用于原发性肝细胞癌临床治疗提供理论依据。方法:MTT方法检测L-OHP对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测L-OHP诱导HepG2细胞周期阻滞的作用;RTPCR和Western blot方法观察L-OHP对细胞周期调节因子CyclinD1、CDK2、CDK4及p16、p21、p53表达的影响。结果:MTT结果显示L-OHP对HepG2细胞增殖抑制率随药物浓度增加及作用时间延长有升高趋势,呈时间剂量依赖性。L-OHP能够诱导HepG2细胞周期阻滞于S期,并可下调CDK4和CyclinD1蛋白的表达,上调p21,p53蛋白的表达,CDK2和p16表达无明显变化。结论:L-OHP可能通过影响CDK4、CyclinD1及p21的活性使HepG2细胞阻滞在S期,从而抑制肝癌细胞HepG2的增殖。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

[目的]探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为.[方法]将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclinD1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况.[结果]Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclinD1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达.流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G2/M期进展.MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加.[结论]HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclinD1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关.     

Hsp70.1在冬凌草甲素处理的肝癌细胞中的作用研究

目的 研究Hsp70.1在冬凌草甲素处理后的肝癌细胞HepG2中的表达情况及其与冬凌草甲素抗肿瘤活性的关系。方法 采用蛋白印迹法及实时荧光定量PCR技术观察Hsp70.1在冬凌草甲素处理的肝癌细胞HepG2的表达变化,并采用RNA干扰技术观察抑制Hsp70.1表达后对冬凌草甲素抗肝癌效果的影响。结果 冬凌草甲素作用12 h后,HepG2细胞的Hsp70.1蛋白及RNA表达均增加。Hsp70.1 短发夹RNA（shRNA）转染抑制Hsp70.1表达后,与对照组相比,Hsp70.1 shRNA转染组、冬凌草甲素处理组或两者联合应用组的HepG2细胞的存活率均明显降低。 结论Hsp70.1可促进HepG2细胞的生存,对HepG2细胞和冬凌草甲素处理的HepG2细胞具有保护作用。     

DACH1在肝癌中的生物学作用及机制

目的探讨DACH1在肝癌中的生物学作用及其作用机制,为肝癌的早期诊断、治疗和预后评估提供帮助。方法采用免疫组化方法检测30例肝癌组织和配对的正常组织样本中DACH1的表达水平。运用Western Blot方法检测DACH1,筛选出低表达DACH1的肝癌细胞株。构建过表达DACH1的慢病毒转染HepG2细胞株,并通过Western Blot方法验证DACH1表达改变的情况。采用CCK8检测高表达DACH1的HepG2细胞株在24、48、72、96 h增殖情况。采用流式细胞技术检测高表达DACH1的HepG2细胞株周期变化情况,并运用Western Blot方法检测周期相关蛋白CyclinD1、CDK4、Cyclin E1、CDK2表达变化情况。高表达DACH1的HepG2细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察体内增殖情况并用采用免疫组化验证肿瘤中DACH1的表达。结果DACH1在肝癌组织中的表达低于正常组织(P <0.001);DACH1在肝癌细胞中的表达低于正常肝细胞株,HepG2、Hep3B、Huh7细胞系中HepG2的DACH1表达最低(P <0.05)。高表达DACH1的... 更多     

抑制ATM表达对X线照射下肝癌细胞损伤修复的影响

目的 探讨抑制毛细血管扩张-共济失调突变基因(ATM)表达对人肝癌细胞株HepG2在X线照射下细胞损伤修复的影响.方法 设计3条沉默ATM的小分子干扰RNA(siRNA)的序列,用脂质体法转染HepG2细胞,筛选出有效的浓度及作用时间,分别利用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测ATM mRNA、蛋白表达水平,MTT法检测转染后细胞增殖,流式细胞术检测X线照射后HepG2细胞周期、凋亡等生物学功能方面指标的变化.结果 筛选出沉默ATM基因的siRNA有效序列.qRT-PCR结果 显示第3条siRNA抑制率最高,可达72%,转染后48 h的ATM蛋白表达抑制78%.转染siRNAATM 后HepG2细胞的增殖能力无明显变化,HepG2ATM组在X线照射后G2/M期细胞明显增多,S期细胞明显减少;X线照射后HepG2ATM组早期凋亡百分比是阴性对照组的2倍.结论 抑制ATM表达可显著抑制肝癌细胞对辐射损伤的修复,为后期研究ATM在肝癌治疗中的作用机制提供了实验基础.     

shRNA干扰基膜聚糖调控肝癌细胞侵袭和迁移能力的实验研究

目的 本研究旨在探索沉默基膜聚糖(lumican)对肝癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制。方法 通过shRNA沉默肝癌细胞HepG2和MHCC97H中的lumican。通过实时定量PCR（qRT-PCR)检测细胞中lumican的mRNA水平,Transwell检测细胞侵袭,划痕实验分析细胞迁移。蛋白印记检测lumican、MMP-9、VEGF、ERK1、JNK、p-ERK1和p-JNK蛋白水平。结果 肝癌细胞HepG2和MHCC97H中lumican的mRNA水平和蛋白质水平高于正常肝细胞L02 (P<0.01)。HepG2和MHCC97H细胞中lumican shRNA组mRNA水平和蛋白质水平低于对照组(P<0.01)。与scramble组相比,HepG2和MHCC97H细胞中lumican shRNA组细胞侵袭和迁移显著降低(P<0.01)。HepG2和MHCC97H细胞中lumican shRNA组MMP-9和VEGF表达低于scramble组(P<0.01)。与scramble组相比,HepG2和MHCC97H细胞中lumican shRNA组p-ERK1和p-JNK蛋白水平下降(P<0.01)。结论 shRNA干扰lumican通过抑制ERK1/JNK通路激活减弱肝癌细胞侵袭和迁移。     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.