腺病毒介导的小鼠Flt3配体抗肝癌基因治疗的研究

目的　观察腺病毒载体介导的小鼠Flt3配体 (mFL)对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法　腺病毒体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1 6 ,4 8h后 ,用绿色荧光蛋白的表达检测感染的效率 ,ELISA检测培养上清中mFL的表达量 ,每天细胞计数 (连续 14d)观察细胞的生长曲线。建立小鼠肝癌模型 ,肿瘤局部分别单次注射 1× 10 9表达形成单位的mFL重组腺病毒、空载体对照和PBS ,观察肿瘤大小和小鼠生存期。治疗 2 0d后 ,取肿瘤消退小鼠的脾细胞过继至正常小鼠 ,3d后接种Hepa1 6细胞 ,观察肿瘤大小 ;治疗 38d后 ,再接种Hepa1 6细胞或EL4细胞对照于肿瘤消退小鼠原接种部位的对侧 ,观察肿瘤大小并作统计学处理。结果　腺病毒体外能有效地感染靶细胞Hepa1 6 ,培养上清中mFL表达量为 80 .5ng·10 -6·2 4h-1± 7.3ng·10 -6·2 4h-1,感染后Hepa1 6的生长未受到明显抑制。瘤体内注射mFL重组腺病毒导致 90 %的小鼠肿瘤消退 ,并显著延长小鼠生存期 ;脾细胞过继能保护正常小鼠免于Hepa1 6细胞的攻击 ;再接种Hepa1 6细胞于肿瘤消退小鼠 ,未见肿瘤生长 ,而再接种的EL4细胞呈渐进性生长 ,与对照组无显著差异。结论　腺病毒介导的小鼠Flt3配体的基因治疗导致肿瘤消退 ,并能激发可过继的、特异性免疫保护反应 ,可能成为有效的肝癌基因治疗的候     

C57BL／6j小鼠接种Hepa1-6细胞诱导皮下肝癌模型的建立

目的探讨Hepa1-6接种于C57BL／6j小鼠皮下建立适合免疫学研究的肿瘤模型的可行性。方法Hepa1-6细胞培养传代3～4次后，收集并浓缩为3个浓度梯度：5×10^6／ml，1×10^7／ml和2×10^7／ml。按0．1ml／鼠的量接种于C57BL/6j小鼠皮下。调查每组的皮下肿瘤形成率。接种7d后。每3天测量肿瘤的最大直径及横径。计算肿瘤体积、生长速率及倍增时间。再得出生长曲线。观察荷瘤鼠与未接种鼠的生存时间；HE染色观察肿瘤病理学特点。结果Hepa1-6细胞培养24～36h。即可进行1：3的细胞传代。A，B组以及C组的成瘤率分别为10％（1／10）。20％（2／10）和90％（9／10）。最早扪及米粒大小的肿瘤结节的时间分别为19，10和7d。荷瘤小鼠生存时间为49～73d，中位生存时间为57．5d。平均生存时间为（61．4±12．2）d；非荷瘤小鼠生存时间为74～103d。中位生存时间为85d，平均生存时间为（85．6±15．1）d（t=3．45，P〈0．05）。肿瘤HE染色见肿瘤细胞排列不规则，多见病理性核分裂。结论以C57BL／6j为实验鼠，按2×10^6／小鼠的细胞量，皮下接种Hepa1-6细胞。能成功建立适合进行微波消融相关的免疫学层面研究的皮下肝癌模型。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

自体肿瘤免疫激活剂诱导抗肝癌免疫的研究

[目的]采用含有固定的肝细胞癌(HCC)细胞或组织碎片、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-2(IL-2)的生物可降解缓释微球和结核菌素的肿瘤免疫激活剂进行皮内接种,观察对小鼠肝肿瘤的预防免疫作用和预防HCC切除术后复发的效果.[方法]动物实验:C57BL/6J小鼠尾部皮内注射Hepa1-6肿瘤免疫激活剂两次,第2次免疫注射后7d,左后肢皮下注射1×107活Hepa1-6细胞,观察肿瘤的生长情况.临床研究:50例肝癌根治切除术后病人采用随机、对照的方法分为免疫激活剂接种组和对照组.[结果]Hepa 1-6细胞注射同源性小鼠后,对照组18只小鼠全部发展成肝肿瘤;而接种含有固定Hepa1-6细胞的免疫激活剂B组的18只小鼠中有4只无肿瘤生长;含有IL-2/GM-CSF微球和结核菌素的C组18只小鼠中有3只无肿瘤生长;而含有固定Hepa1-6细胞和IL-2/GM-CSF微球和结核菌素的肿瘤免疫激活剂(D组)18只小鼠中12只无肿瘤生长,67%小鼠获得保护.在HCC肿瘤免疫激活剂的临床试验中未见副作用.24例病人中17例出现了抗HCC迟发型超敏反应.剂量-1、剂量-2免疫激活剂组术后1,2,3年复发率分别为25%(25%),37.5%(37.5%)和50%(37.5%);剂量-4免疫激活剂组术后1,2年复发率分别为0%,12.5%.而对照组HCC切除术后1,2,3年复发率分别为30.8%,53.8%和61.5%.接种剂量-2、4 HCC免疫激活剂病人的术后复发率明显低于对照组(P＜0.05).[结论]这种细胞因子缓释微球的肝癌免疫激活剂具有较强的抗小鼠肝肿瘤的效果;可预防肝癌切除术后复发.     

小鼠循环肝癌细胞模型的建立与评价

目的 采用小鼠肝癌Hepa 1-6细胞建立小鼠肝癌循环肿瘤细胞（CTCs）模型。方法 采用雄性C57BL/6小鼠108只,按照体重分为3组,每组36只。3个组分别每只尾静脉接种0.2 mL的浓度为1×10⁶、5×10⁶和1×10⁷个/mL的小鼠肝癌Hepa 1-6细胞单细胞悬液。各组分别于接种后第1、5、9、13、17、21天检测采血,采用流式细胞术检测,计算2万个有核细胞中CTCs数目及比例、相对CTCs抑制率,记录动物死亡率。②采用雄性C57BL/6小鼠80只,按体重分为2组,分别为模型对照组、甲苯磺酸索拉菲尼组,每组40只。每只尾静脉接种0.2 mL的浓度为5×10⁶个/mL的Hepa 1-6细胞单细胞悬液,接种后第2天开始灌胃给予甲苯磺酸索拉菲尼（50 mg/kg）,连续21 d,并于给药第3、8、15、21天采血进行CTC检测。结果 ①接种浓度为1×10⁶个/mL的细胞悬液后,第1、5、9、13、17、21天的动物CTCs比例为：25.1%、18.1%、8.9%、4.4%、2.9%、0.3%,未出现动物死亡;接种浓度为5×10⁶个/mL的细胞悬液后,第1、5、9、13、17、21天的动物CTCs比例为：40.4%、35.4%、15.4%、9.0%、6.6%、4.1%,未出现动物死亡;接种浓度为1×10⁷个/mL的细胞悬液后,第1、5天的动物CTCs比例为：39.1%、33.5%,在接种完毕之后立即出现动物死亡,且所有动物在接种后第7天全部死亡。②甲苯磺酸索拉菲尼给药期间D₃、D₈、D₁₅、D₂₁相对循环肿瘤细胞清除率分别为：-7.5%、4.6%、55.3%、-94.5%,与模型对照组比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。结论 采用浓度为5×10⁶个/mL小鼠肝癌细胞Hepa 1-6悬液尾静脉注射可建立小鼠肝癌CTC模型,可用于抑制循环肿瘤细胞药物的筛选与评价。     

Flt3配体修饰小鼠肝癌疫苗的制备及其体内抗肿瘤活性观察

目的:以小鼠Flt3配体(murine flt3 ligand, mFL)的重组腺病毒载体(AdmFL)体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6制备肝癌疫苗,并观察其体内抗肿瘤活性.方法:腺病毒载体体外感染Hepa1-6细胞,48 h后通过载体所携带的绿色荧光蛋白(GFP)的表达检测感染的效率;并用ELISA方法检测第0、2、4、6、8天培养上清中mFL的表达量;每天进行细胞计数(连续14 d),观察细胞的体外生长曲线;取5×106个修饰后的Hepa1-6细胞接种C57BL/6小鼠,4周后于原接种部位的对侧再接种2×106个野生型Hepa1-6或EL4细胞.结果:AdmFL能有效感染靶细胞Hepa1-6,培养上清中mFL表达量在第2天最高,达到(71.1±6.3) ng/ml,感染后Hepa1-6的体外生长未受到明显抑制;修饰后Hepa1-6细胞的体内成瘤性下降;4周后再接种Hepa1-6细胞,肿瘤生长速度明显降低;而再接种的EL4细胞呈渐进性生长,与对照组相比无显著差异.结论:腺病毒介导的Flt3配体基因修饰后的肝癌细胞的体内成瘤性下降,并能激发特异性免疫保护反应,是有效的肝癌疫苗.     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。     

消除小鼠肝脏冰冻切片自发荧光4种封闭方法的比较

目的 通过对小鼠肝脏冰冻切片进行不同的封闭处理,探寻消除小鼠肝脏自发荧光的最佳方法,以降低对免疫荧光阳性信号的干扰,提高免疫荧光结果的准确性。方法 （1）经脾静脉注射肝脏荷瘤裸小鼠：将Hepa1-6-GFP细胞通过脾脏注射方法使其在雄性无胸腺BALB/c裸小鼠肝脏定植,并将肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行AB液（内源性生物素封闭液）、blocking、AB液+blocking、丙酮+AB液+blocking封闭处理,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。（2）C57BL/6小鼠：对C57BL/6小鼠肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行上述4种封闭处理,用F4/80标记肝巨噬细胞（Kupffer细胞）,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。结果 肝脏组织冰冻切片免疫荧光染色时,4种封闭处理都可以减弱肝脏切片的自发荧光,但丙酮+AB液+blocking封闭处理效果最佳。结论 丙酮+AB液+blocking联合应用对小鼠肝脏组织冰冻切片自发荧光的消除效果最好。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

C.novyi-NT抗肝癌细胞作用的实验研究

【立论依据】 2001 年Dang等通过研究Clostridium novyi(C.novyi)对结直肠肿瘤、黑色素瘤的作用发现,它能够引起广泛的肿瘤细胞坏死;为了减少其致病性,C.novyi 中编码外毒素的基因被去除,成为C.novyi-NT(Nontoxicgenenic C.novyi)菌株。研究人员将C.novyi-NT 芽胞通过尾静脉给予荷瘤裸鼠,有趣的是,C.novyi-NT除了在肿瘤中生长外,却并不累及其它正常组织;实验结果表明C.novyi-NT在肿瘤低氧区域弥散分布,并引起该区域肿瘤细胞明显坏死,整体上缩小肿瘤体积,且具有约30%的治愈率。C.novyi-NT对肿瘤的杀伤作用被证实与引起机体免疫反应有关,但具体机制仍不清楚。随后C.novyi-NT芽胞被用来联合抗肿瘤药物、放射疗法,均表现出令人振奋抗肿瘤协同作用。目前C.novyi-NT的抗肿瘤研究已进入I期临床试验,以评估其安全性。 【设计思路】 基于已有的研究基础,我们提出C.novyi-NT对肝癌具有治疗作用,且是通过诱导机体产生免疫炎性反应起到杀伤作用;另外,通过联合索拉菲尼、紫杉醇等化疗药物,能够起到协同作用。 【实验内容】 (1)建立鼠肝癌H22荷瘤小鼠模型:观察肿瘤生长情况,统计小鼠存活天数;(2)C.novyi-NT 芽胞的制备:诱导C.novyi菌株芽胞形成,通过物理方法去除毒力基因,得到C.novyi-NT芽胞;(3)C.novyi-NT抗肝癌作用的研究:将C.novyi-NT芽胞通过尾静脉注入荷瘤小鼠,观察肿瘤生长变化、测量肿瘤体积,统计小鼠治愈率、死亡率,检测血管生成指标及免疫指标;联合C.novyi-NT与肿瘤化疗药物索拉非尼、紫杉醇处理荷瘤小鼠,观察抗肿瘤效果并检测血管生成、免疫指标。 【材料】 C.novyi;H22鼠肝癌细胞株;BALB/c小鼠;索拉菲尼;紫杉醇。 【可行性】 本项目立论依据充分,有大量的相关研究工作作为基础;实验设施及实验环境均满足本项目要求,并受到微生物学教研室主任李明远教授指导;项目研究团队均为基础医学基地班学生,通过平时各类科研训练,已有一定的实验基础。 【创新性】 此项目为肿瘤学、微生物学、免疫学等多学科交叉,并与转化医学紧密结合。此项目将首次揭示C.novyi-NT对肝癌的治疗作用及具体机制,并通过C.novyi-NT联合肿瘤化疗药物对肝癌的协同治疗作用,为耐药性肿瘤的治疗提供新的治疗策略。     

新疆黑蜂胶调节小鼠T细胞亚群及细胞因子作用研究

【立论依据】 蜂胶调节人体免疫细胞功能,具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等功效,应用前景广阔。目前研究蜂胶在疾病中免疫激活和调节作用主要集中在其对固有免疫(如吞噬细胞)的激活作用,对蜂胶调节T细胞亚群的功能及其增强特异性免疫应答的作用机制,目前文献报道甚少,对新疆黑蜂胶免疫调节功能的研究尚无文献报道。 【设计思路】 研究新疆黑蜂胶对小鼠T细胞亚群的转化和功能影响,初步探讨其免疫调节和抗肿瘤功能的机制。 【实验内容】 (1)新疆黑蜂胶体外诱导小鼠淋巴细胞增殖实验,采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖活性,并获得初步实验结果即新疆黑蜂胶对淋巴细胞具有激活作用且存在明显的浓度依赖性。(2)研究新疆黑蜂胶对小鼠T细胞亚群的调节作用,应用流式细胞技术、CBA法或ELISA法分别检测服用不同剂量黑蜂胶粗品的小鼠Treg、Th17、CTL细胞亚群及其分泌的细胞因子(TGF-β、IL-10、IL-17、IL-2、IFN-γ),分析新疆黑蜂胶对T细胞亚群形成的免疫平衡作用以及正/负调节免疫应答的机制。(3)开展新疆黑蜂胶体外抗肿瘤实验。采用流式细胞技术等方法检测和观察黑蜂胶对小鼠肿瘤细胞凋亡,分析其对Fas凋亡受体表达的正调节作用。以上几项研究均采用高中低三个不同蜂胶剂量,同时探讨其功能与药物剂量的相关性,并筛查黑蜂胶有效作用浓度。 【材料】 新疆黑蜂胶醇提粗制品;Balb/C小鼠;MTT,检测小鼠Treg、Th17、CTL的荧光标记抗体试剂,检测小鼠CK的抗体标记CBA;流式细胞仪、酶标仪等仪器。 【可行性】 本次课题成功立项新疆医科大学2013年大学生科研项目,本课题项目团队在教师指导下提取了黑蜂胶并已完成实验内容1,为其余实验做了很好的准备,在我校内具有实验所需仪器和技术支持。 【创新性】 新疆黑蜂胶产品是珍贵的本土资源,具有很高的经济和科研价值。目前研究蜂胶的免疫功能主要集中在其对固有免疫(如吞噬细胞)的激活作用,对蜂胶调节T细胞亚群研究文献报道甚少,对新疆黑蜂胶免疫调节功能的研究尚无文献报道。     

β-catenin 在二噁英诱导的男性不育症中的作用机制

【立项依据】 不孕症已成为世界范围内广泛关注的问题,其中男性不育症占约50%,并有逐渐增加趋势。研究表明,环境污染导致的男性不孕问题尤为突出,并成为急需解决的问题。 【设计思路】 近年来,β-连环蛋白(β-catenin) 信号通路在生殖系中的作用日益受到瞩目。β-catenin调节睾丸内生殖细胞发生发育的功能、调控睾丸曲细精管索的正常发育、苗勒氏管的退化等。但其在环境毒素诱导的男性不育症中的机制尚不清楚。 【实验内容】 雄性C57BL/6小鼠 (8周龄,体重20 g)随机分为2组,每组8只:对照组(1个月)和染毒组(1个月)。适应性饲养1周后染毒,染毒组采用灌胃方式,一次性给予50 μg/kg 的二噁英(TCDD),对照组仅给予玉米油。染毒结束后以股动脉放血方式处死所有实验动物。我们将利用精子数检测、H-E 染色法观察TCDD对精子的影响,并用TUNEL染色法观察细胞凋亡。睾丸中的同时利用免疫组化染色法检测β-catenin在睾丸中的组织学分布,并用免疫蛋白质印迹法检测β-catenin的变化。 【材料】 动物:雄性C57BL/6小鼠;药物:玉米油,TCDD;染色液:二甲苯,乙醇,伊红酒精溶液,苏木精染液,TUNEL;抗体:β-catenin 【可行性】 (1)参阅大量文献, 具有坚实可靠的理论依据。(2)课题组成员均全力工作,有能力按时完成本课题。(3)具有完善的实验设备及技术支持。 【创新性】 报道TCDD诱导的精子发生异常中β-catenin的变化,揭示新的有效的TCDD调节因子。     

天灸抗小鼠移植性肿瘤作用及对免疫功能的影响

目的:观察天灸疗法对抗小鼠移植性肿瘤作用并从免疫学角度探讨其作用机制。方法:昆明种健康小鼠30只随机分为正常对照组、肿瘤对照组、天灸组。将S₁₈₀瘤株接种于肿瘤对照组和天灸组小鼠右腋部皮下,观察各组动物的胸腺指数、脾脏指数、淋转及NK细胞活性。结果:天灸能明显抑制S₁₈₀实体瘤的生长,抑瘤率达38.52%.荷瘤小鼠脾脏重量增加,胸腺重量减小;天灸能进一步增加荷瘤小鼠脾脏和胸腺重量。荷瘤小鼠脾T淋巴细胞对ConA的增殖反应能力、NK细胞的杀伤活性均大大降低,而天灸能明显提高T淋巴细胞的应答能力和NK细胞的杀伤活性。结论:调节机体的免疫功能是天灸抗肿瘤作用的机制之一。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

基于TFH-B细胞轴探讨白芍总苷治疗CIA小鼠的作用机制

【立论依据】 类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病,其发病原因尚不明确,B细胞产生的抗体在RA的发病机制中起着重要作用,TFH是辅助B细胞主要的T细胞亚群。白芍总苷具有多途径抑制自身免疫反应,对类风湿关节炎具有确切疗效,因此,拟基于TFH-B细胞轴探讨白芍总苷治疗CIA小鼠的作用机制。 【设计思路】 通过白芍总苷对牛Ⅱ胶原诱导关节炎(CIA)小鼠脾脏中TFH-B细胞表型、mRNA表达水平、血清中相关细胞因子、Ig亚类的影响,初步探讨白芍总苷治疗CIA小鼠中对TFH-B细胞轴的影响。 【实验内容】 将DBA小鼠分为白芍总苷组、益赛普组、布洛芬组、模型组以及空白组,每组15只小鼠。通过牛Ⅱ胶原与弗氏佐剂1 d,14 d免疫小鼠,建立CIA小鼠模型。末次免疫后,各实验组小鼠隔日灌胃给药,并采用关节炎指数(AI)评分法每日评价小鼠关节炎症程度,至第28天。采用流式细胞术检测脾脏中CD3+CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞及B细胞的表型;荧光定量RT-PCR法检测脾脏中Bcl-6和ICOS表达水平;酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测血清中相关细胞因子IL-21、IL-17、TGF-β以及Ig不同亚类的水平;免疫组化方法检测脾脏中CXCR5+ICOS+TFH细胞、B细胞的分布及滑膜处炎细胞的浸润。 【材料】 流式细胞术抗体、细胞因子ELISA检测试剂盒、荧光定量PCR试剂盒等。 【可行性】 小组成员已掌握了CIA小鼠模型的建立方法以及小鼠的灌胃,尾静脉注射等实验技术,已发表相关SCI论文一篇。新疆医科大学基础医学院形态中心实验室及病原生物学重点实验室可提供实验所需设备及相关实验指导。 【创新性】 TFH是辅助B细胞功能主要的T细胞亚群, TFH对B细胞的相关调节作用在RA发病中相关机制的研究较少;白芍总苷对RA治疗作用的机制尚未有定论,通过测定小鼠脾脏中Bcl-6和ICOS转录水平,从转录水平、细胞因子水平及细胞水平探讨白芍总苷对TFH细胞的影响和作用机制。     

人源脂肪干细胞治疗小鼠脊髓损伤的研究

【立论依据】 脊髓损伤(SCI)是一种高致残率、高耗费的多发重症疾病。相比现有治疗方式,干细胞替代治疗前景广阔、效果更佳,且人源脂肪干细胞(hADSCs)取材容易、无免疫原性、无伦理争议,是临床治疗SCI引起神经功能丧失疾病的理想种子细胞。 【设计思路】 建立小鼠SCI模型,体外分离培养hADSCs,将其诱导分化为运动神经细胞(hADSCs-MN)并注入小鼠受损脊髓内;通过行为学评分(BMS)、动物电生理、组织病理学观察等方法追踪hADSCs或hADSCs-MN在损伤脊髓内的迁移去向、分化方向和功能整合情况。 【实验内容】 hADSCs的分离、纯化、培养并鉴定,体外诱导hADSCs为hADSCs-MN并鉴定,其中,hADSCs-MN用表达绿色荧光蛋白的慢病毒标记简称ANF,未诱导的hADSCs用相同慢病毒标记简称AF,hADSCs-MN用过表达Thymidine Kinase及mCherry荧光蛋白的单纯疱疹病毒标记简称ANH,未诱导的hADSCs用相同单纯疱疹病毒标记简称AH。C57雌鼠采用显微镜下钳夹法钳夹脊髓T9节段造模,术前1天及术后记录BMS评分直至处死,造模1周后分五组(分别为注射ANF、AF、ANH、AH的A、B、C、D实验组各10只和注射PBS的对照组10只)。细胞注射后第7周取每组部分小鼠注射Ganciclovir(杀死过表达Thymidine Kinase的ANH和AH组细胞),另取部分小鼠注射WGA和BDA,所有小鼠通过动物电生理检查神经传导通路恢复情况。细胞注射后第8周对所有小鼠进行灌注取脊髓,常规制片,通过WGA及BDA逆行、顺行神经示踪剂示踪外源细胞在损伤脊髓内的功能整合情况;通过用神经细胞标记物MAP2、GFAP及运动神经元标记物ChaT、HB9、Islet进行免疫组化观察脊髓生理状态及外源细胞在脊髓内的迁移去向、分化方向和功能整合情况。 【材料】 50只6周C57雌性小鼠;人源脂肪;诱导液;双抗;手术及显微外科器械;立体定向仪等。 【可行性】 相关文献已证实hADSCs具有多向分化潜能,可帮助恢复受损神经功能,Suelen等证实钳夹型SCI造模法可取,预实验手术成功率达94%。 【创新性】 采用模拟性强、稳定性好、精确性高的显微镜下钳夹法造模;巧妙设置多组对照,对hADSCs以及hADSCs-MN对SCI的治疗效果进行探究,为临床上SCI的治疗方案提供实验基础。     

调气消积汤对Lewis肺癌小鼠免疫功能影响的实验研究

[目的]探讨调气消积汤对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响。[方法]C57BL/6小鼠常规接种Lewis肺癌,随机分为:荷瘤对照组(MG)、调气消积汤组(TG)、顺铂组(DG)、综合组(ZG);健康的小鼠组成空白对照组(CG),每组10只。观察各组对脾脏指数的影响,计数小鼠外周血T淋巴细胞转化率及脾T淋巴细胞的增殖情况,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。[结果]调气消积汤可使荷瘤小鼠的脾脏指数降低并趋向正常,与空白组比较无差异(P>0.05)。从小鼠T淋巴细胞转化率及增殖活性来看,调气消积汤组比荷瘤对照组明显升高,差异显著(P<0.01)。调气消积汤组移植瘤TNF-α蛋白的表达,与荷瘤对照组比较无明显差异(P>0.05)。[结论]调气消积汤对Lewis肺癌小鼠的免疫器官(脾)有一定的保护作用;可以通过提高荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞转化率、脾T淋巴细胞增殖活性,来增强荷瘤小鼠的免疫功能;对肿瘤组织中TNF-α蛋白的表达无明显促进和抑制作用。     

细胞表面α2,6-唾液酸在肝癌细胞粘附中的作用及机制研究

【目的】 分析比较细胞表面不同连接方式的唾液酸在小鼠肝癌高淋巴道转移细胞株Hca-F和低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达,并研究差异性表达的α2,6-唾液酸在肝癌细胞淋巴结黏附行为中的作用及分子机制。 【方法】 利用免疫细胞化学、流式细胞技术,分析肝癌细胞表面不同连接方式的唾液酸在Hca-F和Hca-P中的表达差异;通过RNA干扰技术干预差异表达的唾液酸转移酶,并使用RT-PCR、蛋白质印迹及Lectin-blot方法检测其干扰效果;利用细胞黏附实验和凝集素阻断实验,检测干扰前后、阻断前后Hca-F细胞黏附能力的变化;利用FAK信号通路特异性抑制剂,探讨α2,6-唾液酸介导肝癌细胞黏附行为的分子机制。 【结果】 α2,6-唾液酸在小鼠肝癌高、低转移细胞株中表达具有显著差异,而α2,3-唾液酸的表达无显著差异;当通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中ST6Gal-I表达下调时,其细胞表面α2,6-唾液酸表达减少,削弱Hca-F细胞对淋巴结的黏附能力降低。此外,ST6Gal-I表达下调可抑制p-FAK及下游p-paxillin蛋白分子的表达。 【结论】 细胞表面α2,6-唾液酸可通过FAK信号转导通路正性介导肝癌细胞的黏附行为,为肝癌的治疗提供新的靶点。     

香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响

【目的】 纯化的香菇多糖(lentinan, LNT)为香菇子实体提取物中的有效成分,是兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂,在临床上有广泛应用。树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,激活T细胞应答并在抑制肿瘤的发生、发展和转移中起到重要作用,同时DC疫苗也在防止多种传染病和肿瘤治疗等方面展现广阔前景。我们在科研见习期间通过研究发现LNT对DC有显著调节作用。但是具体的机理不清,而且国内外未见报道。因此,我们立项对LNT影响小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 表型及功能的变化进行了如下系统研究。 【方法】 取6~8周龄C57BL/6小鼠,颈椎脱臼处死,于75%酒精中浸泡10~15 min,无菌手术取出四肢放入75%酒精中,剔去肌肉,剪掉骨头两端,用1 mL无菌注射器吸取RPMI1640反复冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,1 500 r/min,离心6 min,倒掉上清,加入1~2 mL红细胞裂解液1~2 min,用PBS洗3遍后重悬于含双抗和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中,接种于6孔板,24 h后弃去未贴壁细胞,再加入含GM-CSF、IL-4、双抗和10%FCS的RPMI1640,隔天半量换液,培养至对数期,加药刺激。LNT溶解于RPMI1640中,配制其浓度为50 μg/mL,然后加入培养至对数生长期的BMDCs细胞培养液中, 用RPMI1640培养作为空白对照组,10 ng/mL的LPS(Sigma)刺激培养作为阳性对照。分别应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪术、吞噬实验及酶联免疫吸附试验,检测酸性磷酸酶活性、细胞表型及细胞因子IL-12、IL-10及TNF-α含量。 【结果】 与RPMI1640对照组相比,LNT处理组(50 μg/mL)BMDCs酸性磷酸酶活性明显下降(P<0.01);表面关键膜分子CD80、CD86,CD40、CD83,MHC Ⅱ、和CD205的表达水平明显增高(P<0.01);吞噬FITC-dextran量(反映摄取抗原能力)减少(P<0.05);细胞上清液中IL-12、IL-10及TNF-α含量明显增高(P<0.01)。 【结论】 本研究表明适宜浓度的LNT能够显著促进BMDCs表型和功能成熟。     

PSGL-1基因敲除小鼠血中MIP-1γ和TNF-α的表达

目的 研究PSGL-1缺失对遗传基因工程小鼠外周血血常规的影响,并检测外周血中炎症因子IGFBP-6、TNF-α和MIP-1γmRNA表达水平。方法 用血常规检测方法检测正常C57/BL/6小鼠和PSGL-1基因缺失的基因工程小鼠（PSGL-1^-/-小鼠）的外周血中血常规的差异;其次,提取两种鼠的血液的mRNA,逆转录为cDNA,采用real-time PCR方法,检测C57小鼠与PSGL-1^-/-小鼠外周血中炎症因子 TNF-α和MIP-1γmRNA的差异。结果 与对照组C57小鼠相比,PSGL-1^-/-基因工程小鼠在12周龄时外周血中中性粒细胞（^*P<0.05）、淋巴细胞（^**P<0.01）和白细胞细胞（^***P<0.001）总数显著增加炎症因子TNF-α以及MIP-1γ表达增加（P<0.05）。结论 PSGL-1的缺失改变了小鼠细胞因子并影响了外周血的血细胞组成,MIP-1γ和TNF-α炎症因子上调,有可能影响了小鼠的免疫功能。