心肌线粒体改变对1型糖尿病小鼠心脏结构与功能的影响

目的 探讨心肌线粒体改变对1型糖尿病小鼠心脏结构与功能的影响。方法 20只8周龄雄性C57/BL6J小鼠随机分为对照组（n=10）,1型糖尿病组（n=10）。单次腹腔注射STZ（150mg/kg）建立1型糖尿病动物模型,实验到达终点时采用小动物用高分辨超声仪观察小鼠心脏结构,测量心脏功能;光镜下观察心肌细胞形态改变,透射电镜下观察心肌细胞线粒体变化,Western blot法检测线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α。原代培养C57BL/6J乳鼠心肌细胞,观察在不同糖浓度（5mmol/L、33mmol/L）中培养48h后心肌细胞的形态学变化,透射电镜下观察心肌细胞线粒体的改变,Western blot法检测线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α。结果 与正常组小鼠相比,1型糖尿病组小鼠心肌线粒体排列不规则,肿胀,脊脱落溶解,线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α表达减低（P< 0.05）,1型糖尿病小鼠心脏肥大,室壁增厚,心功能减低。与正常糖浓度培养组相比,高糖培养组线粒体肿胀、脊断裂溶解,线粒体相关蛋白TFAM及PGC-1α表达减低（P<0.05）,心肌细胞肥大显著,形态欠规则。结论 心肌线粒体结构与功能的改变与1型糖尿病小鼠心脏结构与功能改变有关。     

胎球蛋白B上调致糖尿病缺血/再灌注心肌易损性增加及机制

【立论依据】 糖尿病患者缺血性心脏病(IHD)的发病率及心肌损伤程度明显高于正常人群,亟需探寻有效防治措施。胎球蛋白B(Fet-B)是由肝细胞和心肌细胞合成并分泌的糖蛋白。我们预实验发现,2型糖尿病小鼠心肌Fet-B的表达较正常小鼠高出4.84倍,且能与心肌胰岛素受体结合,诱导胰岛素下游PI3K-Akt通路受损、葡萄糖转运子4转位减少,提示心肌Fet-B表达增加可能与心肌胰岛素敏感性受损有关。此外,转录调节因子FoxO1在糖尿病状态下表达增加,然而其与Fet-B高表达的关系尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在预实验基础上,在整体和细胞水平,运用药理学方法和基因干预手段研究:2型糖尿病心肌FoxO1/Fet-B表达增加可否通过诱导胰岛素抵抗、从而使缺血/再灌注(I/R)损伤加重,并进一步探讨其机制。 【实验内容】 (1)研究糖尿病心肌Fet-B表达变化、并分析其与心肌胰岛素抵抗的关系:检测糖尿病小鼠血浆和心肌Fet-B水平,给或不给胰岛素,检测胰岛素下游信号;检测心肌FoxO1水平;分离乳鼠心肌细胞,分别用siRNA和腺病毒转染下调和上调FoxO1,检测Fet-B变化。(2)验证糖尿病心肌I/R损伤加重,分析其与Fet-B表达变化的关系:构建ob/ob小鼠心肌I/R模型,检测心肌损伤,分析其与Fet-B表达变化的关系。(3)基因水平验证FoxO1/Fet-B表达与I/R心肌损伤有关:构建Fet-B敲除小鼠I/R模型,给或不给胰岛素,检测心功能及心肌损伤、胰岛素下游信号;再给予Fet-B,检测是否加重心肌I/R损伤和心肌胰岛素抵抗。 【材料】 WT小鼠、ob/ob小鼠、Fet-B敲除小鼠、心肌I/R模型的手术器械、细胞培养所需试剂、细胞凋亡检测试剂盒、有关信号分子的抗体、siRNA和腺病毒、RT-PCR及蛋白质印迹仪器等。 【可行性】 本实验设计立足于前期预实验结果之上,所需实验技术均为常规技术,实验室具备所需仪器,动物与试剂均购到,可行性较好。 【创新性】 Fet-B在糖尿病及心脏方面的研究在国内外均无论文发表。我们首先提出2型糖尿病心肌FoxO1/Fet-B表达增加可诱导心肌胰岛素抵抗,进而导致I/R心肌损伤加重的新机制,并得到预实验的支持,期望为临床防治糖尿病IHD提供新靶点。     

抑制SIRT2介导的心肌程序性坏死改善衰老心肌的缺血耐受

【立论依据】 衰老心肌对缺血/再灌注(I/R)损伤的耐受力显著降低。并且,坏死是I/R心肌死亡最主要的病理途径,但以往认为心肌坏死不可调控。最新发现SIRT2介导的RIP1去乙酰化是触发程序性坏死(Necroptosis)这一可调控性细胞坏死的关键机制。 【设计思路】 本研究以成年和老年组为对比,结合基因和药理学干预,从整体,器官,细胞,分子四个水平进行功能验证, 旨在探讨衰老状态下SIRT2介导的心肌Necroptosis是否是老年心肌缺血损伤加重的新机制。 【实验内容】 采用成/老年C57小鼠建立整体心肌I/R(30 min/4 h)模型。分别于基础状态和I/R后检测各组心肌SIRT2表达水平及其活性;RIP1的乙酰化水平。采用免疫共沉淀方法检测RIP1-RIP3复合物(necrosome)水平;免疫组化方法检测下游分子MLKL的质-膜转位;再灌注后测定心肌梗死面积。采用成年SIRT2 KO和RIP3 KO小鼠建立心肌I/R平行实验,分析SIRT2介导的促坏死在心肌缺血易损中的关键作用。进而,采用心肌点注射腺病毒或siRNA 上调/下调成年和老年心肌SIRT2的表达,在整体水平明确衰老状态下心肌SIRT2对I/R心肌Necroptosis以及心肌损伤的影响。运用离体心脏灌流结合SIRT2特异阻断剂AGK2和Necroptosis抑制剂nec-1,建立成/老年小鼠离体心脏I/R模型。在器官水平探讨干预SIRT2介导的Necroptosis能否抑制衰老心肌死亡。再则,建立体外心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型,使用AGK2或nec-1处理细胞;采用细胞动缘探测系统观察单心肌细胞收缩舒张功能;流式细胞仪检测PI和Annexin V双阳性细胞定量检测心肌Necroptosis程度与细胞存活率。在细胞水平阐明干预SIRT2介导的Necroptosis促进衰老心肌存活的分子机制。 【材料】 成年(4个月龄)及老年(22个月龄)C57小鼠。 【可行性】 老年组I/R心肌SIRT2活性显著增高,RIP1乙酰化水平随之降低,necrosome水平升高,MLKL细胞质-膜转位增加(均P<0.05)。离体灌流实验发现,AGK2可有效抑制老年I/R心肌SIRT2活性,减小老年组心肌损伤。心肌细胞实验显示,抑制SIRT2介导的Necroptosis可提高H/R后心肌存活率(均P<0.05)。现有的实验结果表明本设计切实可行。 【创新性】 我们有望首次证实:SIRT2介导的Necroptosis加重是老年心肌缺血易损性增加的重要原因;针对性的抑制心肌SIRT2可显著改善衰老心肌抗I/R损伤能力。本研究将为降低老年缺血性心脏病患者的心肌损伤提出新的干预靶点。     

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征对大鼠海马神经细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响

目的 观察阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）大鼠海马细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。方法 将24只成年雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组进行OSAS模型复制，复制成功后继续饲养，按饲养时长分为2周组、4周组和6周组；对照组无特殊处理。每组6只。Western blotting检测大鼠海马细胞线粒体自噬相关蛋白LC3（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）、p62、PINK1及Parkin蛋白相对表达量；用透射电子显微镜观察其线粒体的变化。结果 实验组大鼠模型复制前后最低血氧饱和度和平均血氧饱和度的比较，差异有统计学意义（P <0.05），即OSAS模型复制成功。与对照组比较，2周组、4周组和6周组大鼠海马神经细胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于对照组，p62蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）；进一步两两比较，4周组LC3、LC3Ⅱ/LC3ⅠPINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于2周组，p62蛋白相对表达量低于2周组（P <0.05）；6周组LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于4周组，p62蛋白相对表达量低于4周组（P <0.05）。透射电镜观察，与对照组比较，2周组、4周组和6周组大鼠海马区可见被双层或多层磷脂双分子层包裹的线粒体自噬体。结论 OSAS可致大鼠海马神经细胞发生线粒体自噬，其自噬程度随饲养时间延长而加重。     

球形脂联素对间歇低氧所致H9C2细胞损伤的保护作用及机制

目的：探讨Parkin介导的线粒体自噬在球形脂联素(globular adiponectin,gAPN)减轻间歇低氧(intermittent hypoxia, IH)所致H9C2心肌细胞损伤中的作用及相关机制。方法：建立H9C2细胞IH模型来模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征。 采用流式细胞术检测细胞凋亡。采用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)。采用免疫印迹法检测Parkin、Bax、Bcl-2蛋白表达。采用Parkin siRNA抑制Parkin基因表达。采用LC3与线粒体红色荧光探针进行荧光共定位检测线粒体自噬。结果：IH暴露后,H9C2细胞凋亡率、Bax及Parkin蛋白表达水平、线粒体自噬明显升高,MMP下降,Bcl-2 蛋白表达水平下降;给予gAPN保护后,IH+gAPN组细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平较IH组下降,MMP较IH组升高,Bcl-2及 Parkin蛋白表达水平、线粒体自噬也较IH组升高。抑制Parkin基因表达后,线粒体自噬明显下降,线粒体损伤、心肌细胞凋亡率明显增加。结论：gAPN通过上调Parkin介导的线粒体自噬减轻IH所致H9C2心肌细胞损伤。     

组织激肽释放酶1改善大鼠心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍

目的 探讨组织激肽释放酶1（KLK1）对心脏缺血/再灌注损伤大鼠线粒体功能的影响及其机制。方法 通过KLK1重组腺病毒感染实现大鼠心脏KLK1过表达,然后采用冠状动脉左前降支结扎和再灌注的方法建立大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型,检测梗死区面积和心脏缺血危险区细胞凋亡情况;分离大鼠心脏缺血危险区心肌组织线粒体,检测线粒体功能（线粒体过氧化物生成量、线粒体膜电位、线粒体ATP生成量）。分离新生大鼠心肌细胞,通过KLK1重组腺病毒感染实现KLK1过表达,然后建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,对心肌细胞缺氧/复氧损伤模型应用缓激肽1型受体（B1R）阻断剂R715或缓激肽2型受体（B2R）阻断剂HOE140处理,利用MTT法检测细胞活力,并观察线粒体功能的变化。结果 在大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型中,KLK1过表达能减轻心肌缺血/再灌注损伤,使心肌梗死区面积减小、缺血危险区细胞凋亡减少（P均<0.01）;改善心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍,降低过氧化物生成量、增加线粒体膜电位和线粒体ATP生成量（P均<0.01）。在离体大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中,KLK1过表达能减轻心肌细胞损伤（P<0.05）、改善线粒体功能障碍（P<0.05,P<0.01）,并且其作用可被B2R阻断剂HOE140抑制。结论 KLK1能改善心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍,这可能是其具有心脏保护作用的重要机制。     

KATP通道Kir6.2亚基E23K多态性对阿霉素损伤大鼠心肌细胞结构及自噬的影响

目的 构建携带KATP通道Kir6.2亚基E23K多态性的大鼠模型,给予阿霉素损伤,探讨KATP通道Kir6.2亚基E23K多态性对于阿霉素损伤的心肌,心肌结构、功能及细胞自噬的影响。方法 利用定点突变的方法获得含有Kir6.2 KK基因型的大鼠并进行基因鉴定。将大鼠随机分为4组,即A组（WT+Saline组,SD大鼠+生理盐水）、B组（E23K+Saline组,Kir6.2 KK大鼠+生理盐水）、C组（WT+DOX组,SD大鼠+阿霉素）、D组（E23K+DOX组,Kir6.2 KK大鼠+阿霉素）。采用腹腔注射阿霉素的方法构建阿霉素损伤大鼠模型,对照组腹腔注射等体积的生理盐水。应用心脏彩超进行阿霉素损伤心肌病模型的鉴定及心脏结构和功能的评价（每组8只）。分别通过HE染色及天狼星红染色心肌组织切片,测量心肌细胞面积及心肌纤维化比例,并通过PCR方法检测纤维化相关标志物CTGF、TGF-β mRNA的表达。通过Western blot法技术测定心肌细胞自噬水平。结果 超声结果显示,阿霉素损伤的大鼠相比于盐水组存在明显的心肌重构及功能损伤（P<0.01）,且E23K组变化较WT组更明显（P<0.01）。病理及纤维化相关标志物mRNA表达显示,阿霉素损伤的大鼠心肌纤维化程度明显加重（P<0.01）,且E23K组纤维化程度较WT组更严重（P<0.01）;自噬相关蛋白表达量检测显示,阿霉素损伤的大鼠,自噬相关蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且E23K组明显高于WT组（P<0.01）。结论 在阿霉素损伤模型中,Kir6.2亚基E23K多态性对大鼠心脏结构、功能、纤维化程度及自噬表达均有显著影响。     

胶质细胞源性神经营养因子在大鼠神经病理性疼痛模型中的作用及机制研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）通过PINK1/Parkin信号通路对大鼠神经病理性疼痛的作用及其机制。方法 将大鼠按随机数字表法分为Sham组、NP组和GDNF组。对大鼠的一般情况和行为学进行观察和测定;透射电镜观察大鼠脊髓;Western blotting法观察大鼠脊髓组织中PINK1和Parkin蛋白表达。结果 Sham组大鼠的情况良好;与Sham组比较,术后NP组大鼠侧肢体后爪有内收的现象,偶有大鼠跛行;GDNF干预后大鼠的情况明显好于NP组大鼠。3组大鼠机械缩足反射阈值（MWT）和热痛阀值（TWL）在坐骨神经压榨性损伤（CCI）的阈值无明显的变化（P >0.05）;术后3 d、7 d和14 d的MWT和TWL比较,NP组大鼠较Sham组大鼠降低（P <0.05）;NP组大鼠脊髓组织中完整自噬小体双膜结构较少,线粒体分别出现肿胀甚至空泡变性,还有大量的线粒体消失不见,少数出现与溶酶体融合;经过GDNF干预后,GDNF组大鼠在各个时间的MWT和TWL较NP组大鼠升高（P <0.05）;GDNF组大鼠脊髓组织中少见自噬小体双模结构,线粒体偶见轻微肿胀和空泡变性,未见溶酶体融合。NP组大鼠脊髓组织中的PINK1和Parkin蛋白表达较Sham组升高（P <0.05）;经过GDNF干预治疗后发现,GDNF组大鼠脊髓组织中PINK1和Parkin蛋白降低（P <0.05）。结论 GDNF作用机制可能通过抑制PINK1和Parkin蛋白表达,从而有效减轻神经病理性疼痛。     

MiR-182模拟物提高1型糖尿病小鼠的心脏功能

目的 探讨miR-182模拟物对1型糖尿病小鼠心脏功能的影响及可能作用机制。方法 40只8周龄雄性C57小鼠随机分为正常对照组（n=5）,miR-182模拟物对照组（n=5）,1型糖尿病组（n=15）,1型糖尿病+miR-182模拟物治疗组（n=15）。腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立1型糖尿病动物模型。实验于8周末结束,采用小动物用高分辨超声仪测量小鼠心脏功能;运用透射电镜观察心肌组织超微结构改变;利用real-time PCR技术检测心肌组织β-肌球蛋白重链（β-MHC）,α-肌球蛋白重链（α-MHC）,心房钠尿肽（ANP）,Ⅰ型（Col Ⅰ）和Ⅲ型胶原（Col Ⅲ） mRNA及miR-182 mRNA的表达含量。结果 ①miR-182模拟物可改善1型糖尿病小鼠的心脏功能,增加心脏射血分数及左室短轴缩短率（P<0.01）;②miR-182模拟物可降低糖尿病小鼠心肌组织ANP、Col I、Col Ⅲ的表达及β/a-MHC比值（P<0.01）;③miR182模拟物可改善1型糖尿病小鼠心肌超微结构变化,减轻自噬。结论 MiR-182模拟物能改善1型糖尿病小鼠的心脏功能,其机制可能与减轻心肌肥大和心肌纤维化,减轻线粒体结构损伤及减轻自噬有关。     

羟基红花黄色素A缓解大鼠心肌细胞凋亡作用的研究

目的 以整体和离体实验观察羟基红花黄色素A (HSYA) 缓解心肌细胞凋亡的作用。方法 以异丙肾上腺素 (ISO) 造成大鼠急性心肌缺血,以 TUNEL 法检测心肌组织细胞凋亡,免疫组化法和 RT-PCR 法观察心肌组织中 bax、bcl-2 基因表达的变化;用缺糖缺氧/再复氧模型诱导原代培养心肌细胞凋亡,以 PI 流式细胞法观察凋亡情况,以 Rhodamine 123 荧光法考察线粒体膜电位的变化。结果 60、120、240 mg/kg HSYA ip 给药可以减轻心肌缺血大鼠的线粒体肿胀、核凝集及固缩,降低心肌细胞凋亡率 (P＜0.01),下调心肌组织 Bax 蛋白 (P＜0.05) 及 bax mRNA 的表达 (P＜0.01)。0.64、1.3、2.5 mmol/L HSYA 可减少缺氧/再复氧造成的细胞凋亡 (P＜0.05),且可缓解该损伤造成的心肌线粒体膜电位下降 (P＜0.05)。结论 抑制心肌细胞凋亡是 HSYA 缓解心肌缺血的重要机制。     

PLP2在心肌重构中的动态表达变化

目的 探讨PLP2蛋白在心肌重构心脏组织和心脏各类细胞中的表达改变。方法 用冠状动脉左前降支结扎术建立小鼠心肌梗死后的心脏重构模型、异丙肾上腺素（ISO）皮下注射2周建立小鼠急性心脏损伤模型;胸主动脉结扎术（aortic banding,AB）建立小鼠心肌肥厚的模型。苯肾上腺素诱（PE）导心肌细胞肥大模型;转化生长因子（TGF）β刺激心肌成纤维细胞激活。采用RT-PCR检测上述各种心脏重构模型中PLP2转录水平的改变。结果 PLP2在小鼠心肌梗死（miocardial infarction,MI）术后2周表达明显增高（P<0.05）;在ISO诱导的急性心脏损伤后2周表达增高（P<0.05）;在AB术后1周表达开始增高（P<0.05）,在AB术后2周达到高峰（P<0.05）,持续到AB术后8周（P<0.05）。PLP2在PE诱导的心肌细胞肥大模型中表达增高;在TGFβ刺激的成纤维细胞中表达明显增高。结论 PLP2的表达在不同模型的心脏重构中均发生明显改变,且呈现动态变化,提示其可能参与心脏重构的发生、发展。     

参芪复方对GK大鼠心肌细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax及NO的影响

[目的]研究参芪复方对GK大鼠心肌细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax及一氧化氮(NO)的影响及其可能作用机制。[方法]GK大鼠腹腔注射N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME),同时给予高脂饮食复制2型糖尿病(T2DM)心肌病变模型。选择随机血糖≥11.1mmol/L的GK大鼠随机分为4组:模型组、中药高、低剂量组、西药组,另设正常Wistar大鼠作正常对照组,共5组动物。治疗4周后,统一取心肌标本,通过免疫组化等测量方法,对照观察各组药物对GK大鼠一般状态、心肌NO、心肌Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。[结论]GK大鼠的上述指标存在明显异常。参芪复方特别是其高剂量组能改善其一般状态、升高心肌NO(P<0.01),升高心肌细胞凋亡抑制因子Bcl-2的表达(P<0.01),降低促细胞凋亡因子Bax表达(P<0.05)和Bax/Bcl-2比值(P<0.01)。[结论]凋亡相关因子Bcl-2和Bax与NO参与糖尿病心肌损伤过程,参芪复方能升高心肌NO,降低心肌Bax表达,升高Bcl-2表达。     

SSR在心肌重构过程中的表达改变

目的 探讨SSR在心肌重构过程中的表达改变。方法 采用冠状动脉左前降支结扎术建立小鼠心肌梗死后的心肌重构模型、异丙肾上腺素（ISO）皮下注射2周建立小鼠急性心脏损伤模型;胸主动脉结扎术（aortic banding,AB）建立小鼠心肌肥厚的模型。采用RT-PCR检测各种心肌重构模型中SSR转录水平的改变。结果 SSR亚单位1（SSR1）和3（SSR3）在小鼠心肌梗死（miocardial infarction,MI）术后2周表达明显降低（P<0.05）;在ISO诱导的急性心脏损伤后2周表达降低（P<0.05）;在AB术后1周表达降低（P<0.05）。然而SSR1和SSR3的表达在AB术后2周开始增高（P<0.05）,持续到AB术后8周（P<0.05）。结论 SSR1和SSR3的表达在不同模型的心肌重构中均发生明显改变,且呈现动态变化,提示其可能参与心肌重构的发生、发展。     

ISL-1表达水平对胃癌细胞化疗耐药性的影响及机制探究

【立论依据】 化疗是一种重要的胃癌辅助治疗方法,但由于不同患者对化疗药物的耐药性差异极大,而影响其治疗效果。哪些因素会导致胃癌细胞呈现不同的耐药性目前尚未阐明。最新的研究表明,自噬可以帮助细胞对抗微环境中的化疗药物,导致耐药。胰岛因子1(Islet-1,ISL1),在正常成体胃组织中不表达,但我们发现ISL1在人胃癌组织中呈中等丰度的表达,且不同胃癌细胞系表达量有明显差异,并对胃癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性亦不同。胃癌细胞中ISL1表达量的差异是否与化疗耐药性相关,目前国内外尚未见报道。我们还发现,5-FU处理下,ISL1表达丰度高的胃癌细胞,其自噬发生标志LC3的剪切也明显增加,那么ISL1是否通过增强肿瘤自噬能力来介导胃癌细胞的化疗耐药性?故本课题试图阐明胃癌细胞中ISL1表达量的差异可导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性,其分子机制与ISL1能够增强肿瘤自噬能力有关。 【设计思路】 (1)明确胃癌细胞中ISL1表达量的差异能否导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性;(2)证实胃癌细胞中自噬与耐药性的关系;(3)探究ISL1与自噬之间的相关性,阐明ISL1促进肿瘤耐药性的机制是通过促进自噬来实现的。 【实验内容】 (1)CCK-8实验和蛋白质印迹实验分别检测ISL1表达量不同的两株胃癌细胞系对5-FU的耐药性差异和自噬强度;(2)过表达/敲低ISL1,检测两种细胞对5-FU的耐药性变化和自噬强度;(3)在过表达或敲低ISL1基础上抑制或增强自噬,检测两株胃癌细胞系在5-FU处理下的自噬强度和各自耐药性的改变。 【材料】 人胃癌细胞系MGC803、MKN28;5-FU;CCK-8试剂盒;过表达或抑制ISL1的质粒;雷帕霉素;3-甲基腺嘌呤;各蛋白抗体。 【可行性】 本实验所涉及的转录因子ISL1为本实验室主要研究对象,因此,本实验在理论指导、材料准备上都有很大的可行性。 【创新性】 自噬与肿瘤耐药之间的关系尚无定论;自噬在胃癌细胞耐药性中的作用也未见报道。因此,本实验属理论创新,且具有应用价值,对肿瘤治疗乃至药物靶点设计方面都有一定意义。     

PINK1-Parkin线粒体自噬在创伤性脑损伤小鼠中的作用

目的探讨PINK1-Parkin线粒体自噬在创伤性脑损伤(TBI)中减轻神经细胞线粒体功能障碍及凋亡的保护作用。方法 36只小鼠随机分为野生对照组(野生小鼠接受假手术)(n=6);基因对照组(Parkin-/-小鼠接受假手术)(n=6);野生模型组(野生小鼠接受TBI)(n=18),并将其分为TBI 1、3、5 d组,各6只小鼠;基因模型组(Parkin-/-小鼠接受TBI)(n=6)。采用控制性皮层损伤法建立TBI模型。Western blot检测线粒体自噬相关蛋白(PINK1表达、Parkin移位)及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3);JC-1法检测线粒体膜电位;TUNEL法检测神经细胞凋亡;干湿重比法检测脑水肿;mNSS评分评价小鼠神经功能缺损。结果与野生对照组比较,野生模型组PINK1及线粒体Parkin表达显著增加,细胞质Parkin表达显著下降,其中在第3天最为明显,分别为(326.0±21.9)%、(300.0±23.1)%及(57.0±6.6)%;与野生对照组比较,野生模型组第3天脑组织含水量、mNSS评分、神经细胞线粒体JC-1单体含量、凋亡率、cleaved caspase-3及Bax表达显著增加为(77.3±3.5)%、(9.7±1.5)分、(143.5±22.6)%、(16.3±3.9)%、(184.0±19.5)%及(201.0±21.7)%,Bcl-2表达显著下降为(77.0±5.1)%。与野生模型组比较,基因模型组第3天脑组织含水量、m NSS评分、神经细胞线粒体JC-1单体含量、凋亡率、cleaved caspase-3及Bax表达进一步显著增加为(83.0±4.3)%、(13.8±1.9)分、(194.5±26.1)%、(34.2±6.9)%、(297.0±15.0)%及(303.0±28.5)%,Bcl-2进一步显著下降为(57.0±7.0)%。结论在TBI小鼠中,PINK1-Parkin线粒体自噬通过减轻神经细胞线粒体功能障碍及凋亡发挥神经保护作用,针对PINK1-Parkin线粒体自噬的干预可能作为治疗TBI的潜在治疗靶点。     

神经肽Y/Y1受体激活β⁃catenin信号通路介导心肌细胞损伤

目的：研究神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）/Y1受体信号转导在心肌细胞损伤中的作用及机制。方法：C57BL/6J小鼠皮下注射异丙肾上腺素（isoprenaline,ISO）构建心肌损伤模型,腹腔注射Y1受体特异性拮抗剂BIBO3304干预。小鼠随机分为对照组（生理盐水）、ISO组［20 mg/（kg·d）ISO］、BIBO3304+ISO组［0.1 mg/（kg·d）BIBO3304+20 mg/（kg·d）ISO］、BIBO3304组 ［0.1 mg/（kg·d）BIBO3304］,每组10只,连续给药14 d。实时定量PCR和Western blot检测小鼠心肌组织中NPY表达。HE染色和Masson染色观察各组小鼠心肌纤维结构变化和纤维化程度;定量PCR检测小鼠心肌肥大基因心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）、β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）mRNA表达。采用Y1受体特异性激活剂［Leu31,Pro34］-NPY刺激 H9C2 细胞,检测 ANP、β-MHC mRNA 表达;CCK-8 检测心肌细胞活力。Western blot 检测各组小鼠心肌组织和 H9C2 细胞中 active β-catenin、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phospho-glycogen synthesis kinase 3β,p-GSK3β）、总糖原合成酶激酶-3β（total glyco- gen synthesis kinase 3β,t-GSK3β）蛋白表达。免疫荧光染色检测心肌细胞β-catenin 入核情况。利用β-catenin 特异性抑制剂 ICG001处理细胞,检测［Leu31,Pro34］-NPY诱导的心肌细胞肥大和细胞活力变化。结果：与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织 NPY mRNA 和蛋白表达均显著增加（P < 0.05）,心肌纤维排列紊乱,心肌纤维化程度高,心肌肥大基因表达增加。与 ISO 组比较,BIBO3304+ISO组小鼠心肌损伤和纤维化得到有效缓解,心肌肥大基因表达下降（P < 0.01）。与对照组比较,［Leu31, Pro34］-NPY 增加 H9C2 细胞 ANP、β-MHC mRNA 表达,降低心肌细胞活力（P < 0.01）。与对照组比较,ISO 组小鼠心肌组织 active β-catenin、p-GSK3β表达明显上调,p-GSK3β/t-GSK3β增加;与 ISO 组比较,BIBO3304+ISO 组心肌组织 active β-catenin、 p-GSK3β表达降低（P < 0.05）。与对照组比较,［Leu31,Pro34］-NPY 显著增加心肌细胞 active β-catenin、p-GSK3β表达（P < 0.05）,促进细胞核β-catenin 积累。与［Leu31,Pro34］-NPY 组比较,BIBO3304 抑制细胞核β-catenin 表达,ICG001 显著缓解 ［Leu31,Pro34］-NPY诱导的心肌细胞肥大和细胞活力下降（P < 0.01）。结论：NPY通过Y1受体转导激活β-catenin信号通路介导心肌细胞损伤和心肌纤维化。     

槲皮黄酮改善心肌细胞肥大过程中对线粒体功能及动力学的影响

[目的]探讨槲皮黄酮对原代心肌细胞肥大、线粒体功能及动力学的影响。[方法]原代培养大鼠心肌细胞,采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及槲皮黄酮共同干预细胞48、72 h后,BCA试剂盒检测细胞中蛋白浓度,倒置显微镜分析心肌细胞直径;酶标仪检测心肌细胞内三磷酸腺苷（ATP）及活性氧（ROS）含量,JC-1方法分析心肌细胞线粒体膜电位（MMP）;蛋白免疫印迹（Western Blot）方法测定线粒体动力学相关蛋白视神经萎缩蛋白（OPA1）、动力相关蛋白（Drp1）及磷酸化动力相关蛋白1（p-Drp1）表达量。[结果]与空白组比较,模型组心肌细胞中总蛋白浓度、细胞直径大小及ROS水平显著升高（P<0.05）,ATP和MMP值则显著降低（P<0.05）,Western Blot结果发现OPA1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,p-Drp1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,槲皮黄酮处理72 h后心肌细胞中总蛋白浓度、细胞直径大小及ROS水平显著降低（P<0.05）,ATP和MMP值则显著升高（P<0.05）,Western Blot结果发现OPA1蛋白表达水平显著增高（P<0.05）,p-Drp1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。[结论]槲皮黄酮对AngⅡ引起的心肌细胞肥大具有保护作用,其作用机制可能与降低心肌细胞线粒体功能障碍、稳定线粒体动力学平衡相关。     

精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化对大肠癌自噬的影响

【立论依据】 精氨酸特异性单ADP核糖基化是蛋白质翻译后修饰重要形式,目前研究极少。 我们先前研究首次报道了精氨酸特异性单ADP核糖基化转移酶(ART1)对小鼠大肠癌细胞运动、黏附等具重要作用并与Rho 表达有关。有研究表明,自噬基因Beclin-1在大肠癌中表达率高,可促进大肠癌发生发展;Rho信号通路与自噬调节有关。但精氨酸特异性单ADP核糖基化是否可通过Rho影响大肠癌细胞自噬水平,对大肠癌细胞生长发挥调节作用尚不清楚。 【设计思路】 基于前期工作基础,本研究拟通过改变ART1在大肠癌细胞的表达改变精氨酸特异性单ADP核糖基化水平,观察大肠癌细胞自噬相关蛋白、Rho及其下游与肿瘤增殖相关效应分子表达以及癌细胞增殖能力和小鼠移植瘤生长变化,探讨精氨酸特异性单ADP核糖基化作用对大肠癌自噬的影响及其机制,为寻求大肠癌治疗新靶点提供实验依据。 【实验内容】 构建ART1基因沉默和过表达慢病毒载体转染大肠癌CT26细胞使精氨酸特异性单ADP核糖基化水平改变;电镜观察自噬小体的形成;蛋白质印迹或RT-PCR法检测自噬相关蛋白(Lc3、Beclin-1)表达、Rho蛋白家族Rho1、Rac和Cdc42及其下游与肿瘤增殖相关效应分子(c-fos、c-myc)的变化;采用CCK-8、流式细胞术和动物移植瘤模型,观察大肠癌细胞增殖和生长。 【材料】 小鼠大肠癌CT26细胞,相关蛋白抗体,逆转录试剂盒,Balb/c小鼠,CCK-8试剂盒等。 【可行性】 自噬是细胞存活的必要因素,其形成过程与Rho有关;大肠癌中,自噬相关基因Beclin-1表达高于正常组织,其可促进大肠癌肿瘤的发生发展。本研究前期研究已显示,抑制ART1可下调Rho相关信号转导。因此,我们推测通过下调ART1抑制精氨酸特异性单ADP核糖基化作用,可下调Rho信号转导,进而下调大肠癌细胞自噬水平具有充分的理论依据。先前对精氨酸特异性单ADP核糖基化在大肠癌黏附、迁移等方面的研究,也为本研究奠定了基础。 【创新性】 本研究首次通过观察精氨酸特异性单ADP核糖基化作用与大肠癌自噬以及与Rho信号通路关系,阐明精氨酸特异性单ADP核糖基化作用对大肠癌细胞自噬的调节作用和机制。     

谷红注射液对脑缺血大鼠大脑皮质线粒体功能的改善作用

目的 观察谷红注射液对缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质线粒体功能的影响。方法 采用线栓法制备SD大鼠大脑中动脉梗阻（MCAO）复灌模型,术后即刻给药,连续给药14天后通过神经功能缺损症状评分及贴纸去除实验评价药效。采用Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白Beclin1、Parkin、KIFC2、SNAP-25及UCP3的表达变化。结果 与模型组相比,谷红注射液能显著减轻缺血再灌注模型大鼠的神经功能缺损症状及恢复感觉运动功能,并有效逆转缺模型大鼠大脑皮质组织中线粒体与上述自噬相关蛋白表达的变化。结论 谷红注射液改善脑缺血损伤的作用机制可能与激活线粒体自噬功能有关。     

结直肠癌合并2型糖尿病的临床特征分析

【目的】 探讨合并2型糖尿病(DM2)的结直肠癌患者的临床特点,了解高血糖对直结肠癌的影响。 【方法】 回顾性分析31例合并有2型糖尿病的结直肠癌患者临床病历资料(实验组)和60例结直肠癌无糖尿病患者(对照组),分析结直肠癌合并2型糖尿病患者的高血压情况、临床分期及远处转移的特点。 【结果】 无糖尿病组伴有高血压者16.7%,结直肠癌伴2型糖尿病组为29%,差异无统计学意义(P>0.05);无糖尿病组淋巴结及器官转移率为21.7%,合并2型糖尿病的结直肠癌组为46.2%,差异有显著性(P=0.02);高血糖对于结直肠癌患者的性别、TNM分期的影响无统计学差异(P>0.05)。 【结论】 伴有2型糖尿病的结直肠癌患者较单纯结直肠癌患者更易发生转移,2型糖尿病增加了结直肠癌转移的危险性。