外源性p53基因增强卵巢癌细胞对化疗和放疗的敏感性

目的 探讨外源性p53基因转染对人卵巢癌细胞系的化疗、放疗敏感性的影响。方法 用分子克隆技术构建人野生型 p53基因与真核细胞表达载体 pcDNA3的重组体（pcDNA-p53）,并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的卵巢癌SKOV-3细胞中,经 G418筛选,Northern blot及Western blot鉴定后,观察p53基因转染对顺铂或X线放射作用的SKOV-3细胞的集落形成的影响。结果 成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体。外源性 p53基因在转染细胞中有效表达,增强了顺铂或X线放射对 SKOV-3细胞集落形成的抑制作用。结论 外源性p53基因能增强卵巢癌细胞对顺铂或放射的敏感性,p53基因治疗与化疗或放疗联合作用能更大程度地杀灭肿瘤细胞。     

人肺癌ILK基因siRNA重组表达质粒的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的构建人肺癌整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)基因siRNA重组表达质粒,并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列,克隆至载体pGenesil-1中,构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK,利用脂质体转染A549细胞,经G418稳定筛选后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞中ILK基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组表达质粒pGenesil-1-ILK经SalⅠ单酶切及测序证明构建正确,其转染A549细胞后,细胞ILK基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),且细胞的增殖能力也显著降低(P<0.05)。结论成功构建了人ILK基因siRNA重组表达质粒,ILK基因沉默可显著抑制A549细胞增殖,为肺癌靶向基因治疗的研究提供了新的思路。     

P4HB基因真核表达质粒的构建及在人肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高。结论成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中。本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。     

人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

目的构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达。方法以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的基因的表达。结果所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48h后,目的基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339bp的目的基因条带。结论已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

牛Ⅱ型链球菌vanB2基因真核表达质粒的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2基因真核表达质粒,并在宫颈癌HeLa细胞中进行表达。方法以牛Ⅱ型链球菌基因组为模板,采用PCR法扩增van B2基因,克隆至真核表达载体pVAX-1中,构建重组表达质粒pVAX-1-van B2。采用FuGENE HD Transfection Reagent试剂盒将重组表达质粒转染HeLa细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测转染细胞中van B2基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Western blot法检测转染细胞中van B2蛋白的表达。结果重组表达质粒pVAX-1-van B2经双酶切及测序鉴定构建正确;重组表达质粒转染HeLa细胞48 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR及Western blot分析分别可见570 bp及相对分子质量20 900的目的条带。结论成功构建了牛Ⅱ型链球菌van B2基因的真核重组表达质粒,并在HeLa细胞中成功表达。本实验为进一步研究牛Ⅱ型链球菌对抗生素的耐药性机制及其与van B2基因的相关性奠定了基础。     

RNA干扰技术对MCF-7细胞Aurora-A基因表达的影响

目的构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用。方法将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi-U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定。并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Westernblot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响。结果测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降。结论已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础,并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法。     

人CD52基因的克隆及稳定转染细胞系的建立

目的克隆人CD52基因,构建真核表达载体,并在CHO细胞中稳定表达。方法提取人Hut-78细胞总RNA,采用RT-PCR法扩增CD52基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)/CD52,通过脂质体法转染CHO细胞,建立稳定转染的细胞系CHO-CD52。采用RT-PCR、免疫荧光组化技术及流式细胞术检测目的基因和蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增得到186bp的DNA片段。重组表达质粒pcDNA3.1(+)/CD52经PCR、双酶切及测序证明构建正确。CHO-CD52细胞经RT-PCR分析,可见186bp的目的基因条带;经免疫荧光检测,可见绿色荧光分布;经流式细胞术分析,阳性细胞百分率及荧光平均值分别为98.18和193.56。结论已成功克隆了人CD52基因,并建立了稳定转染的CHO细胞系,为CD52单克隆抗体的制备及抗体药物的开发奠定了基础。     

人葡萄糖调节蛋白78shRNA真核表达质粒的构建及其稳定转染A549细胞系的建立

目的构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 k D,GRP78)shRNA真核表达质粒,并建立其稳定转染A549细胞系。方法根据Gen Bank中登录的人GRP78基因序列(3309)设计3对互补寡聚单链DNA干扰序列(GRP78-mi R-1、GRP78-mi R-2、GRP78-mi R-3)及1对阴性对照,分别插入至载体pc DNA6.2TM-GW/Em GFP,构建shRNA真核表达质粒。在Lipofectamine 3000介导下将各shRNA真核表达质粒分别转染A549细胞,并经Blasticidin S HCl加压筛选稳定的转染细胞系。实时荧光定量PCR和Western blot法检测A549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平。结果各shRNA真核表达质粒经测序鉴定证明均构建正确。稳定转染shRNA真核表达质粒的A549细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光。与空白对照组比较,A549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平明显降低(P0.05),阴性对照组无统计学意义(P0.05)。结论成功构建了人GRP78的shRNA真核表达质粒,并建立了其稳定转染的A549细胞模型,为进一步研究GRP78在肺癌细胞的侵袭和转移中的作用机制奠定了基础。     

Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,转染A549细胞及人胚肺成纤维细胞MRC-5,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果重组表达质粒pEGFP-C1/Surp经双酶切和测序鉴定,证明构建正确。转染A549细胞和MRC-5细胞后,在荧光显微镜下可见A549细胞有较强的绿色荧光,而MRC-5细胞则未见绿色荧光。结论已成功构建以Survivin启动子为调控序列、EGFP为标示蛋白的真核表达质粒,且具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤靶向性基因治疗载体奠定了基础。     

RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响

目的研究RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响。方法以RNAi沉默Bel7402细胞RhoC基因的表达,FACS和RT-PCR检测细胞凋亡和凋亡相关基因水平,细胞划痕损伤和软琼脂克隆形成试验检测细胞迁移和生长特性。结果RNAi组细胞凋亡率明显高于细胞对照组,RNAi组Bcl-2表达水平明显低于细胞对照组,只有RNAi组可检测到Bax基因的表达。两对照组细胞划痕损伤在48h内愈合,而RNAi组则不能修复。RNAi组软琼脂克隆形成能力明显低于两对照组。结论RhoC基因沉默能够促进肝癌细胞Bel7402凋亡并抑制细胞迁移和非锚定生长能力。     

人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1基因siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1(Breast cancer anti-estrogen resistance 1,BCAR1)基因siRNA慢病毒载体,并进行鉴定。方法针对人BCAR1基因靶序列设计并合成4条siRNA序列(PLVT350、PLVT351、PLVT352、PLVT353)及1条阴性对照序列(PLVT4),分别退火后,插入经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的慢病毒载体pMagic 4.1中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,经PCR和DNA测序筛选阳性克隆,提取重组干扰质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞,进行慢病毒包装,浓缩后,采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察感染效率,实时荧光定量PCR检测干扰效率,筛选干扰效果最好的重组慢病毒感染肺癌A549细胞,Western blot检测BCAR1蛋白的表达水平。结果成功构建了4种人BCAR1基因慢病毒干扰质粒,PLVT350、PLVT351、PLVT352和PLVT353的病毒滴度分别为3.45×108、2.13×108、3.01×108和2.47×108TU/ml;慢病毒感染3 d后,A549细胞的感染效率均达90%以上;除PLVT350外,其他3个均为有效靶点,PLVT351、PLVT352和PLVT353的沉默率分别为82%、73%和82%,BCAR1基因的表达量显著低于未转染和PLVT4组A549细胞(P<0.001);PLVT351感染的A549细胞中BCAR1蛋白的表达水平明显低于未感染和PLVT4组A549细胞(P<0.01)。结论成功构建了人BCAR1基因siRNA慢病毒载体,并建立了稳定表达的A549细胞株,为进一步探索BCAR1基因在肺癌中的相关功能及其分子机制奠定了基础。     

人Rac1基因shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Rac1基因shRNA表达质粒,为提高卵巢癌放化疗的敏感性奠定基础。方法根据GenBank中登录的人Rac1基因序列,应用shRNA设计软件设计并合成用于构建shRNA表达质粒的oligo DNA,构建shRNA重组质粒。将阳性Rac1基因shRNA重组质粒经脂质体介导转染卵巢癌Skov3细胞,48 h后经RT-PCR筛选有效的shRNA重组质粒。结果经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ酶切鉴定出阳性Rac1基因shRNA重组质粒,序列比对分析结果与理论序列完全一致。RT-PCR检测显示,转染pGPU6/GFP/Rac1-524的Skov3细胞Rac1基因mRNA的转录水平下降。结论已成功构建人Rac1基因shRNA表达质粒,并筛选出有效的干扰质粒pGPU6/GFP/Rac1-524。     

hepaCAM基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建表达肝细胞黏附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经PmeⅠ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经PmeⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度。RT-qPCR及Westernblot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达。结果酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。